白芷和金银花提取物的抗氧化研究

曾英男，顾宇航，刘 佳

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林 132101）

0 引言

天然提取物抗氧化的机理在于其含有的R-OH可以形成氢自由基，并且可以通过消除一些自由基的活性[1]，起到良好的抗氧化作用。

近年来，研究人员逐渐从白芷中发现了新结构的香豆素类化合物[2]，香豆素类成分主要存在白芷的根部，主要有欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素、白当归素等。金银花中含有丰富的绿原酸等活性物质。从金银花和白芷提取活性成分并研究抗氧化性，为进一步开发新型食品抗氧化剂提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

白芷、金银花，当地超市购买；DPPH·，福州飞净生物科技有限公司提供；欧前胡素标准品（纯度98%）、绿原酸标准品（纯度98%）、ABTS+，合肥博美生物科技有限责任公司提供。

1.2 仪器

KQ-100DE型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；GFL-45型电热鼓风干燥箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司产品；Cary 60型紫外可见分光光度计，安捷伦科技有限公司产品；A-88型组织粉碎机，常州市金坛晨阳电子仪器厂产品；YRE-2000A型旋转蒸发仪，海亚荣生化仪器厂产品。

2 试验方法

2.1 欧前胡素标准曲线的测定

精密称取欧前胡素标准品8.0 mg，甲醇溶解后定容至100 mL。摇匀后配制质量浓度为0.002，0.004，0.008，0.012，0.016，0.020 mg/mL[3]。以甲醇作为空白对照，利用紫外分光光度计于波长200～400 nm处进行扫描，其标准品溶液于波长300 nm处有最大峰值，所以于波长300 nm处测定吸光度，记录吸光度并计算与欧前胡素含量间的关系。

2.2 白芷提取物

白芷干燥根切片粉碎后过40目筛，准确称取50.00 g，按料液比1∶20（g∶mL），乙醇体积分数70%，在超声功率100 W，超声时间20 min，常温条件下，进行超声提取。过滤后减压浓缩除去乙醇有机溶剂，提取液适当稀释用于测定香豆素的含量。最后在45℃恒温烘箱中进行干燥，制得白芷提取物。

式中：C——测定白芷提取液中欧前胡素质量浓度，mg/mL；

V——提取液的体积，mL；

m——白芷粉末的质量，g。

2.3 绿原酸标准曲线的测定

准确称取绿原酸标准品20.0 mg，用适量体积分数70%乙醇溶解后定容至100 mL。取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL（相当于 0.004，0.008，0.016，0.024，0.032，0.040 mg/mL） 溶液到 25 mL容量瓶，用70%乙醇定容后摇匀[4]。以体积分数70%乙醇作为空白对照，利用紫外分光光度计在波长200～400 nm处进行扫描，其标准品溶液在330 nm处有最大峰值，所以于波长330nm处测定吸光度，记录吸光度并计算其与绿原酸含量间的关系。

式中：C——测定金银花提取液中绿原酸质量浓度，mg/mL；

V——提取液的体积，mL；

m——金银花粉末质量，g。

2.4 金银花提取物

金银花粉碎后过40目筛，准确称取50.00 g按料液比为1∶30（g∶mL），乙醇体积分数为60%，在浸提温度为50℃，超声时间为60 min，超声功率为600 W的条件下进行超声提取。过滤后减压浓缩除去乙醇有机溶剂，提取液适当稀释用于测定绿原酸的含量。最后在45℃恒温烘箱中进行干燥，制得金银花提取物。

2.5 DPPH·清除能力的测定

参考文献[5]，准确称取DPPH·20 mg，用无水乙醇溶解定容至50 mL，此时浓度为1.014 4 mmol/L。干燥后的白芷、金银花提取物取0.01 g用水溶解后适当稀释制得样品液；将0.01 g维C用水溶解适当稀释制得对照液，取样品液与2 mL DPPH·溶液混合后避光反应20 min，利用紫外分光光度计于波长517 nm处测定吸光度为Ai；取2 mL样品液与2 mL水混合后避光反应，同样条件下测定吸光度为Aj；2 mL DPPH·溶液和水混合后避光反应，测定吸光度为Ac，同样条件下重复3次，计算平均值。

2.6 ABTS+清除能力的测定

参考文献[5]，配制浓度为7 mmol/L ABTS+溶液：准确称取ABTS+38.41 mg用水溶解后定容10 mL；浓度为140 mmol/L过硫酸钾溶液的配制：过硫酸钾378.45 mg用水溶解后定容至10 mL。取10 mL将ABTS+溶液和179μL过硫酸钾溶液混合，避光保存12～16 h，再用pH值7.4 PBS溶液稀释至适当浓度，使其于波长734 nm处的吸光度为0.70±0.02，即为ABTS+工作液。

干燥后的白芷、金银花提取物取0.01 g用水溶解后适当稀释制得样品液；将0.01 g维C用水溶解适当稀释制得对照液。PBS溶液调零，取样品1 mL与ABTS+工作液4 mL室温避光反应6 min，于波长734 nm处测定吸光度为As，PBS 1 mL和以ABTS+溶液4 mL室温避光反应6 min测定吸光度为A0，同样条件下重复3次，计算平均值。

2.7 数据处理与分析

采用软件Prism 7.0对试验数据进行分析、绘图。

3 结果与分析

3.1 欧前胡素标准曲线的测定

欧前胡素标准曲线见图1。

图1 欧前胡素标准曲线

由图1可知，欧前胡素的标准曲线为Y=56.298X+0.066 8，R2=0.991 9，在 0.002～0.020 mg/mL 质量浓度范围内线性良好。其中，横坐标X为欧前胡素标准品溶液质量浓度，纵坐标Y为吸光度。

样品通过测定吸光度后，计算出白芷提取香豆素得率为3.4 mg/g。

3.2 绿原酸标准曲线的测定

绿原酸标准曲线见图2。

图2 绿原酸标准曲线

由图2可知，绿原酸标准曲线为Y=40.135X+ 0.009 5，R2=0.999 8，在0.004～0.040 mg/mL质量浓度范围内线性良好。其中横坐标X为绿原酸标准品溶液浓度，纵坐标Y为吸光度。样品通过测定吸光度后，计算出金银花提取的绿原酸得率为70.2 mg/g。

3.3 白芷和金银花提取物对DPPH·的清除能力

白芷和金银花提取物对DPPH·清除能力见图3。

由图4可知，白芷提取物和金银花提取物在质量浓度为0.2 mg/mL和0.5 mg/mL时，清除ABTS+自由基均高于同质量浓度的维C，且金银花清除自由基能力优于白芷提取物。另外，提取物的质量浓度在0.5 mg/mL时ABTS+清除率高于0.2 mg/mL，说明在这个范围内，提取物的抗氧化作用与提取物的质量浓度呈正相关，与清除DPPH·的试验结论一致。

图3 白芷和金银花提取物对DPPH·清除能力

4 结论

由图3可知，在白芷提取物DPPH·清除能力在0.2 mg/mL较弱，与维C较为相近，但是当质量浓度在0.4，0.6 mg/mL时清除效果优于维C。金银花提取物的抗氧化效果均优于维C和白芷提取物。同时，金银花和白芷提取物随着质量浓度升高清除作用增加，说明抗氧化作用与提取物的质量浓度呈正相关。

3.4 白芷和金银花提取物对ABTS+的清除能力

在食品中抗氧化剂的应用十分重要，而天然抗氧化剂与化学合成抗氧化剂相比，具有安全、低毒的优点，甚至是可以作为功能性的添加剂。以白芷、金银花为原料，分别用超声方法以乙醇作为溶剂提取天然活性成分，其中白芷中的香豆素得率为3.4 mg/g，金银花中的绿原酸得率为70.2 mg/g，提取液经过浓缩后干燥并研磨为粉末，用水溶解后测定DPPH·，ABTS+的清除能力，发现在白芷提取物在质量浓度为0.4，0.6 mg/mL清除DPPH·能力高于同质量浓度的维C，而金银花清除DPPH·能力较高。白芷提取物和金银花提取物的质量浓度分别在0.2 mg/mL和0.5 mg/mL时清除ABTS+能力均高于维C。以上试验结果均证明，白芷和金银花的提取物均具有较强的清除自由基的能力，抗氧化性较强，可作为天然的抗氧化剂。

图4 白芷和金银花提取物对ABTS+的清除能力