微波和紫外诱变对木霉T-YS菌株生长的影响

程开勇，毛维兴，徐秉良，刘永红，郭耀霞，陈 晶，张 禄，张树武

(甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070)

木霉菌(Trichodermaspp.) 是一类自然界中分布较为广泛的生防真菌，且为土壤微生物的重要群落之一，其常见于土壤、植物残体、植物根围和叶围等环境中[1-2]。有报道，木霉菌不仅具有广谱的抗菌活性，而且具有促进植物发芽、生长和开花等作用[3-6]。因此，利用木霉菌开发安全高效的生物农药具有良好的发展前景。然而，在自然条件下木霉菌的生长容易受到各种不良环境因子的影响，如土壤成分、光照、极端温度、湿度及化学杀菌剂等因素[7]。因此，提高木霉菌的生长能力对发挥其生防功能具有重要意义。前期已有相关学者对影响木霉菌生长的因素做了相关研究，王芊[8]研究了不同光照、温度、碳源、氮源和化学杀菌剂对木霉菌菌丝生长的影响，明确了木霉菌生长的最适温度范围和最佳光照条件等因素，但微波和紫外诱变对木霉菌生长速率和菌丝生长量影响的研究较少。

微波是一种高频率的电磁波，利用微波进行诱变具有设备简单、操作简便、安全可靠和正突变率高的特点[9-10]。同时，紫外照射是一种简便、实用、效果好和值得推广的诱变方式[11]。因此，采用微波诱变和紫外诱变方法测定其对木霉菌T-YS生长的影响，并筛选最佳诱变条件，旨在提高木霉菌生长速率和生长量，为提高木霉菌的生防活力和应用范围提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

木霉T-YS菌株由甘肃农业大学植物病理学实验室筛选并保存。采用PDA培养基马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水定容至1 000 mL；PDB培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸馏水定容至1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 分生孢子悬浮液制备 将分离保存的木霉T-YS菌株接种于PDA平板活化培养，培养6 d，待产生大量绿色分生孢子后，加入1滴吐温-80(Tween-80)和5 mL无菌水，充分振荡使分生孢子脱落于无菌水中。然后，加入无菌水稀释至200倍液，并利用血球计数板在显微镜下计数孢子悬浮液的浓度，配制最终浓度为1×106cfu/mL分生孢子悬浮液，备用。

1.2.2 微波诱变处理 在经灭菌处理的1.5 mL离心管中加入1 mL配制好的木霉T-YS菌株分生孢子悬浮液(1×106cfu/mL)，然后置于700 W格兰仕T770D20T-TD(W0)型微波炉中分别处理15、30、45、60和75 s，并采用冰浴法消除热效应，每隔15 s取出1次，放在冰块上冷却5 s。试验以未经微波诱变处理的菌株作为对照。然后，分别吸取各处理和对照分生孢子悬浮液200 μL均匀涂布于PDA平板，待晾干后置于25℃培养箱中恒温培养，培养3 d后转接于PDA平板进行菌落生长量测定。试验过程中各个处理和对照均重复3次。

1.2.3 紫外诱变处理 吸取配制好的木霉T-YS菌株分生孢子悬浮液(1×106cfu/mL)200 μL，并均匀涂布于PDA平板待紫外诱变处理。诱变处理前先打开紫外灯(10 W)预热30 min，使其功率稳定。然后，将涂有分生孢子悬浮液的PDA平板去盖并置于紫外灯下照射，照射距离为10 cm，分别处理0.5、1、3、5和7 min，并以未经紫外诱变处理的菌株作为对照。处理后立即盖上盖子置于25℃培养箱中恒温培养，培养3 d后将其转接于空白PDA平板进行菌落生长量测定。试验过程中各个处理和对照均重复3次。

1.2.4 诱变对木霉T-YS菌株菌落直径和产孢量的影响 将经微波诱变和紫外诱变的木霉T-YS菌株在PDA平板培养3 d后，利用经灭菌处理的打孔器(Ф=5 mm) 在菌落边缘打取菌饼，并将其转接于新的PDA平板，25℃恒温培养，培养1 d后采用“十字交叉法”测量菌落直径，每隔1 d测定1次，并以原始菌株(未诱变菌株)作为对照，每个处理和对照均重复3次。同时，培养5 d后在PDA平板上加入1滴吐温-80(Tween-80)和5 mL无菌水充分振荡，并使其分生孢子脱落在无菌水中，即得到分生孢子悬浮液的原液，并利用血球计数板计算其产孢量。

1.2.5 诱变对木霉T-YS菌株菌丝干重的影响 将经微波诱变和紫外诱变的木霉T-YS菌株分别配制成浓度为1×106cfu/mL的孢子悬浮液，并吸取1 mL孢子悬浮液接种于30 mL PDB液体培养基中，置于150 r/min恒温摇床25℃振荡培养。培养4 d后发酵液经无菌滤纸过滤，过滤后将收集的菌丝体置于80℃干燥箱恒温烘干后称重。试验以原始菌株(未诱变菌株) 作为对照，每个处理和对照均重复3次。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2003进行数据处理和图表绘制，并采用SPSS 16.0软件进行方差分析。采用多因素方差分析统计各处理平均数差异，以及Duncan氏新复极差法进行处理间差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 微波诱变对木霉T-YS菌株菌落直径的影响

微波诱变对木霉T-YS菌株生长具有不同程度的影响。不同微波诱变时间处理后，木霉T-YS菌株生长随着处理后培养时间的增加而增加。与对照相比，培养第2 d，经微波诱变处理45，60和75 s后其菌落直径明显高于对照，较对照分别提高15.4%，30.8%和23.1%。培养第3 d，经微波诱变处理30，45和60 s和75 s后木霉T-YS菌株菌落直径较对照分别提高2.1%、6.3%、16.7%和10.4%，但在处理后培养第4 d，不同处理下木霉T-YS菌株生长无显著差异。因此，微波处理的最佳诱变时间为60 s (表1)。

表1 不同微波诱变时间处理下木霉T-YS菌株的生长

注：数据均为3个重复的平均值；不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著

2.2 微波诱变对木霉T-YS菌株产孢量的影响

微波诱变对木霉T-YS菌株产孢量具有一定程度的影响。与对照相比，当诱变时间为15～60 s时，诱变菌株产孢量随着诱变时间的增加逐渐增加，尤其当诱变时间为60 s时，其产孢量达到最大值，为2.28×107cfu/mL，且与对照相比差异显著(P<0.05)，但诱变时间增加至75 s时，产孢量显著降低，即微波处理的最佳产孢诱变时间为60 s (表2)。

2.3 微波诱变对木霉T-YS菌株菌丝干重的影响

与对照相比，当微波诱变时间为45～75 s时，诱变木霉T-YS菌株的菌丝干重高于对照菌株，尤其当微波诱变处理60 s时，其菌丝干重达到最大值，较对照提高34.6%。此外，经微波诱变处理45 s和75 s后诱变菌株菌丝干重较对照分别提高1.9%和15.4%。然而，经微波诱变处理15 s和30 s后诱变菌株菌丝干重低于对照，但是与对照菌丝干重相比差异不显著(图1)。

表2 不同微波诱变时间处理下木霉T-YS菌株的产孢量

注：数据均为处理后第5 d的产孢量，同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

图1 不同微波诱变时间处理下木霉T-YS菌株菌丝的干重Fig.1 Effects of different microwave mutagenesis time on mycelial dry weight ofTrichodermaT-YS strain注：不同小写字母表示P<0.05上各处理间的差异性

2.4 紫外诱变对木霉T-YS菌株菌落直径的影响

紫外诱变对木霉T-YS菌株的生长具有不同程度的影响，并且当诱变处理培养第2和3 d时，不同诱变时间对木霉T-YS菌株的生长存在明显的影响。与对照相比，经紫外诱变处理0.5、1、3和5 min后，诱变木霉T-YS菌株培养第2 和3 d时的菌落直径明显高于对照，尤其紫外诱变处理时间为1 min，木霉T-YS菌株的菌落直径达到最高。然而，当诱变处理后培养4 d时，其不同处理对木霉T-YS菌株的生长影响无差异性。因此，紫外诱变处理的最佳诱变时间为1 min (表3)。

表3 不同紫外诱变时间处理下木霉T-YS菌株的生长

2.5 紫外诱变对木霉T-YS菌株产孢量的影响

结果表明，紫外诱变处理对木霉T-YS菌株产孢量具有不同程度的影响，当诱变时间为0.5～1 min时，其产孢量随着诱变时间的增加逐渐增加，尤其是当诱变时间达1 min时其产孢量达到最大值，产孢量为2.31×107cfu/mL。然而，当紫外诱变时间为7 min时，与对照相比其产孢量显著降低，且显著低于对照(表4)。

表4 不同紫外诱变时间处理下木霉T-YS菌株的产孢量

注：数据为处理后第5 d的产孢量，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.6 紫外诱变对木霉T-YS菌株菌丝干重的影响

紫外诱变处理对木霉T-YS菌株菌丝干重具有不同的程度的促进作用，当诱变时间为1 min时，其菌丝干重达到最大值，菌丝平均干重为0.042 g。紫外诱变处理0.5 min和5 min后，其菌丝干重与对照组相比差异显著，菌丝平均干重分别为0.038 g和0.027 g。然而，当诱变时间为3 min和7 min时菌丝干重与对照相比差异不显著 (图2)。

图2 不同紫外诱变时间处理下木霉T-YS菌株菌丝的干重Fig.2 Effect of different ultraviolet mutagenesis time on mycelial dry weight ofTrichodermaT-YS strain注：数据均为3次重复的平均值，小写字母表示在0.05水平上各处理间的差异性

3 讨论

目前，有关提高和改良有益微生物菌株功能的手段主要有诱变育种、紫外诱变、原生质体融合和遗传改造等[12-15]，其中诱变育种技术是一种设备简单、操作简便、安全可靠和应用广泛的微生物菌株改良方法[16-17]。同时，研究表明利用紫外和微波诱变育种手段可显著提高链霉菌产生抗生素的能力[18]。陈力力等[19]通过微波诱变获得高产井冈霉素的菌株4株，其平均效价显著高于突变株17.5%、15.0%、20.0%和21.7%，且其遗传性能稳定；兰时乐等[20]通过微波诱变结合化学诱变的方式，选育获得1株高产纤维素酶的绿色木霉菌株；史君等[21]通过紫外诱变获得1株高产抗菌物质的枯草芽孢杆菌，其诱变条件为15 W和1 min，与试验紫外诱变条件一致。秦涛等[22]通过微波诱变获得经多次传代后遗传性状稳定、滤纸酶活力和羧甲基纤维素酶活力较高的绿色木霉A10突变菌株WB6。周乐聪[23]发现木霉紫外突变株几丁质酶活性和β-1,3葡聚糖酶活性明显高于野生型菌株，且对病原菌的拮抗作用显著增强，但关于如何改良和提高木霉菌生长方面的研究较少。李剑峰等[17]研究发现高效解磷和高产生长素的苜蓿根瘤菌最佳微波诱变功率和诱变时间为600 W (30 s) 和800 W (6 s)。试验结果与前期研究结果相似，但是在诱变时间上略有不同。另外，前期研究表明，微生物菌株经过诱变后，除了对其生长量和生长速率造成影响外，还对其功能产生一定的影响[24]，但是有关微波和紫外诱变对木霉T-YS菌株生防功能的影响在今后还有待进一步研究。

4 结论

试验研究表明2种诱变方式对木霉T-YS菌株生长具有明显的影响，且筛选获得微波诱变最佳时间为60 s (700 W)，紫外诱变最佳时间为1 min (10 W)。研究结果在木霉菌的选育和生防木霉制剂的开发方面具有一定的应用前景，但是有关微波和紫外诱变对木霉T-YS菌株生长影响的机理，以及诱变对其生防功能影响等方面还有待进一步研究。