参麦注射液对肠缺血/再灌注肺损伤大鼠肺组织p38MAPK及凋亡相关基因表达的影响*

赵嘉涵， 贾雨涵， 汤雅婷， 林艺鑫， 王艳蕾

(华北理工大学基础医学院生理学系， 河北 唐山 063210)

肠缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤在小肠移植、严重感染、低氧等疾病的病理演变过程中起重要作用[1]。肠I/R不仅引起消化道局部组织损伤，而且对远隔器官特别是肺的结构和功能造成严重损害[2]。细胞凋亡在肠I/R损伤的病理过程中起重要作用，而凋亡信号的启动与p38MAPK的激活有关[3-5]。参麦注射液(Shenmai injection, SM)是现代中医危重病治疗的常用药物，在临床上主要用于改善缺血时的微循环障碍。本室研究已证实参麦注射液对肠I/R肺损伤具有保护作用，其机制可能与抑制中性粒细胞的聚集，对抗脂质过氧化损伤有关[6]，而参麦注射液的抗肠I/R肺损伤作用是否还与抑制p38MAPK的活化及细胞凋亡有关，目前国内外尚未见相关报道。故本研究通过观察参麦注射液对肠I/R肺损伤大鼠肺组织p38MAPK和凋亡相关基因Bax、Bcl-2蛋白表达的影响，探讨其保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：清洁级SD大鼠24只，体质量(250±50)g，雌雄各半，8周龄，购自北京华阜康生物科技有限公司，动物合格证号：SCXK京2009-0004，动物常规喂养，术前禁食12 h，自由饮水。试剂：参麦注射液(河北神威药业有限公司，批号Z13020888)，Bcl-2、Bax和p38MAPK多克隆抗体及免疫组化测试盒(武汉博士德生物工程有限公司)。主要仪器：石蜡切片机(德国Leica RM2145)，光学显微镜(Olympus 公司)。

1.2 大鼠肠I/R模型制备

大鼠腹腔注射乌拉坦(1 g/kg)麻醉，仰卧固定于手术板上，常规消毒后取腹正中切口3～4 cm，将肠管推向左侧，钝性分离出肠系膜上动脉(superior mesenteric artery, SMA)，在其根部用无创伤血管夹夹闭阻断该动脉血运1 h后松夹，恢复血流后观察1 h，造成大鼠肠I/R损伤模型。

1.3 动物分组及标本采集

实验动物随机分为对照组(Control组)、肠缺血再灌注组(I/R组)、参麦注射液组(SM+I/R组)，每组8只。对照组只分离出肠系膜上动脉，不行夹闭；I/R组和SM+I/R组为造模成功后大鼠。各组分别于夹闭前、松夹前、松夹后30 min 3个时间点对每只大鼠给予如下处理：对照组和I/R组大鼠尾静脉推注生理盐水9 ml/kg；SM+I/R组大鼠尾静脉推注SM 9 ml/kg。各组大鼠于松夹后1 h处死，并取肺组织，一部分-70℃保存，待测相应指标；一部分冰盐水漂净，滤纸吸干，待测肺湿/干比值；一部分经福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋、切片。

1.4 肺组织湿/干比值的测定

取左肺组织，吸干表面水分后称质量，为湿重(wet weight, W)，然后将肺组织置80℃恒温烤箱，干燥48 h至恒重后再称质量，为干重(dry weight, D)，计算肺组织湿重与干重比值(wet/dry weight ratio, W/D)，表示肺组织水肿形成情况。

1.5 肺表面活性物质(PS)的测定

提取肺组织匀浆的磷脂，采用薄层层析法进行分离，然后经无机磷定量法测定PS的主要功能成分卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)及总磷脂(total phospholipid, TPL)的含量[7,8]。

1.6 肺组织p38MAPK及凋亡相关基因Bax和Bcl-2蛋白表达的检测

采用免疫组织化学法，参照试剂盒推荐方法进行。光镜下细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，用吸光度分析软件进行定量分析，每张切片随机选取10个视野(×400)测定其吸光度值(absorbance, A)，计算平均吸光度值(mA)反映其表达强弱。

1.7统计学处理

2 结果

2.1 各组肺组织湿/干比值(W/D)、肺表面活性物质主要功能成分(PC、TPL)含量的变化

I/R组肺组织W/D明显升高，而肺表面活性物质主要功能成分PC和TPL的含量显著降低，与Control组比较差异显著(P<0.01)；参麦注射液治疗后肺组织W/D明显降低，肺表面活性物质主要功能成分PC和TPL的含量增加，与I/R组比较差异显著(P均<0.01，表1)。

GroupW/DPC(mg/g)TPL(mg/g)Control1.75±0.19**8.88±0.86**17.79±0.55**I/R3.23±0.336.58±0.9114.05±0.54SM+I/R2.44±0.17**##8.34±1.05**# 16.59±0.41**#

W/D: Wet/dry weight ratio; PC: Phosphatidylcholine; TPL: Total phospholipid; I/R: Ischemia/reperfusion group; SM+I/R : Shenmai injection treated group

**P<0.01vsI/R group;#P<0.05,##P<0.01vscontrol group

2.2 各组肺组织细胞凋亡相关基因(Bax与Bcl-2)蛋白表达的变化

免疫组化检测结果表明，Bcl-2和Bax免疫组化阳性信号均可不同程度表达于肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及肺小血管壁的胞浆内，呈棕黄色颗粒或匀质状，Control组呈弱阳性表达。肠缺血/再灌注后，肺组织细胞Bcl-2和Bax的表达均明显强于Control组，其中Bax的增强比Bcl-2的增强更为明显，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)。SM+I/R组Bcl-2的表达强于I/R组，而Bax的表达低于I/R组，但仍高于Control组，Bcl-2/Bax比值明显升高(P< 0.01, 表2, 图1)。

GroupBcl-2(mA)Bax(mA)Bcl-2/BaxControl0.052±0.015**0.026±0.002**2.185±0.239**I/R0.089±0.0080.076±0.0031.129±0.058SM+I/R0.113±0.006**##0.058±0.005**##1.935±0.319**##

I/R: Ischemia/reperfusion group; SM+I/R : Shenmai injection treated group

**P<0.01vsI/R group;##P<0.01vscontrol group

Fig.1Expressions of Bcl-2 (A-C) and Bax (D-F) proteins in lung tissues (SP ×400)

A, D： Control group； B, E： I/R group；C, F： SM+I/R group

2.3 各组肺组织细胞p38MAPK蛋白表达的变化

免疫组化检测结果表明，p38MAPK阳性信号不同程度表达于肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及肺小血管内皮细胞的胞浆中，呈棕黄色颗粒，Control组偶有少量阳性表达[(0.092±0.018)mA]，缺血/再灌注后p38MAPK蛋白阳性表达明显增多 ((0.135±0.013)mA，P<0.01)，参麦注射液治疗后p38MAPK蛋白阳性表达明显降低((0.102±0.015)mA，P< 0.01，图2，图3)。

I/R: Ischemia/reperfusion group; SM+I/R : Shenmai injection treated group

**P<0.01vsI/R group;##P<0.01vscontrol group

Fig.3Expressions of p38MAPK proteins in lung tissues (SP ×400)

A： Control group； B： I/R group； C： SM+I/R group

2.4 相关性分析

相关分析显示，肠I/R时肺组织p38MAPK蛋白表达水平与肺表面活性物质主要成分PC含量及凋亡基因Bcl-2/Bax比值呈负相关(r分别为 -0.787，-0.731，P均<0.01)。

3 讨论

本研究结果表明，与对照组比较，I/R组肺组织W/D明显升高，肺表面活性物质主要功能成分PC和TPL的含量明显降低，表明肠缺血/再灌注后肺泡Ⅱ型细胞受损，生成肺表面活性物质减少，降低肺泡表面张力的作用减小，从而使肺泡失去其稳定性，肺顺应性降低，肺泡表面张力对肺毛细血管血浆和肺组织间液的“抽吸”作用增强，导致肺水肿。

既往普遍认为器官组织I/R损伤后最终必将引起细胞坏死，但最近一些研究表明，细胞凋亡在I/R损伤的病理生理过程中起着重要的作用。研究表明，细胞凋亡的发生、发展受到多种基因的调控，上调Bcl-2或下调Bax能抑制细胞凋亡，反之则促进细胞凋亡，Bcl-2/ Bax比值的高低与细胞凋亡密切相关[9]。本研究结果显示对照组肺组织细胞Bcl-2和Bax呈弱阳性表达。肠I/R后，肺组织细胞Bcl-2和Bax的表达均明显强于对照组，其中Bax的增强比Bcl-2的增强更为明显，Bcl-2/Bax比值降低，说明肠I/R时肺损伤与肺组织细胞凋亡有关。而凋亡信号的启动与多种因素有关，近年来研究证实p38MAPK信号通路的激活是启动细胞凋亡的关键因素[10,11]。p38MAPK信号通路是MAPK家族中重要的成员之一，主要经酪氨酸蛋白激酶途径激活，缺血缺氧、自由基、细胞因子等多种细胞外应激刺激可激活p38MAPK，而激活的p38MAPK转移至细胞核内，通过调节相应效应基因的表达，介导细胞的分化、存活、凋亡以及炎症等多种细胞生物学反应[12,13]。那么，p38MAPK信号通路是否参与肠I/R时远隔器官肺损伤的病理过程以及是否与细胞凋亡的启动有关呢，我们又观察了肺组织p38MAPK蛋白表达及其与肺表面活性物质和细胞凋亡的相关性。结果显示，对照组大鼠肺组织仅有很少量p38MAPK阳性表达，而I/R组肺组织p38MAPK蛋白表达明显增强，同时相关分析显示p38MAPK蛋白表达水平与肺表面活性物质主要成分PC含量及凋亡基因Bcl-2/Bax比值呈负相关。因此本文作者推测：肠I/R时p38MAPK信号通路可能参与肠I/R肺损伤的发病过程，而p38MAPK信号通路的激活，启动肺组织细胞凋亡，诱导肺损伤。

参麦注射液源于《症因脉治》中的参冬饮，主要生药成分是红参、麦冬，具有益气固脱、养阴生津的功效。近年研究显示参麦注射液有抗休克、加强机体器官抗应激能力，调节机体免疫功能和抗炎等作用，是现代中医危重病治疗的常用药物。许多研究证实，参麦注射液能改善心、肝、脑等重要脏器的营养性血流量，增强机体耐缺氧能力[14]。研究发现，参麦注射液不仅能改善急性肺损伤患者的呼吸功能，缓解患者内皮功能损伤[15]，而且对大鼠重症急性胰腺炎相关性肺损伤具有明显保护作用[16]。本室研究也证实参麦注射液可通过抑制脂质过氧化损伤保护肢体以及肠缺血/再灌注时肺损伤[6,17]。而前文已证实p38MAPK信号通路及细胞凋亡参与肠I/R肺损伤，那么参麦注射液对肠I/R肺损伤的保护作用是否与p38MAPK信号通路及细胞凋亡有关。本研究发现应用参麦注射液后大鼠肺组织W/D降低，肺表面活性物质含量升高，肺组织p38MAPK蛋白表达水平明显降低，同时肺组织Bax蛋白表达显著下调，Bcl-2蛋白表达上调，Bcl-2/Bax的比值明显升高；而且结果还显示p38MAPK蛋白表达水平与肺表面活性物质主要成分PC含量及凋亡基因Bcl-2/Bax比值呈负相关。因此本文作者认为：参麦注射液可能是通过抑制p38MAPK信号通路的激活，进而下调促凋亡基因Bax的表达，上调抑凋亡基因Bcl-2的表达，提高Bcl-2/Bax比值来阻抑细胞凋亡，从而保护肠缺血/再灌注肺组织。