头孢曲松预处理对局灶性脑缺血损伤的作用研究

庞乃清

山西省大同市第二人民医院肿瘤医院 037006

目前，脑卒中已发展成为威胁人类健康的大敌，患病率呈增长趋势，引起人们高度关注[1]。具体来说，脑卒中是机体受多种因素影响导致脑血管突然破裂或血管堵塞，引发大脑组织缺氧、缺血造成的脑血管疾病，尤其多见缺血性脑卒中[2-3]。众所周知，该病治疗关键为发病后时间窗内早期溶栓治疗，但考虑到时间窗有限，多数患者发病后入院就诊时已错失最佳治疗时机，极易导致出现较多并发症或造成终身残疾，增加其身心痛苦及家庭负担，严重者甚至危及生命[4]。因此，临床采取积极措施，加强脑卒中发病、损伤机理分析，是指导临床制定有效防治方案的关键。相关研究证实，炎症反应与脑缺血再灌注损伤有较大关联，可释放IL-1β等炎性因子，导致脑组织缺血加重[5]。故探寻有效措施控制炎症反应为保护缺血性脑损伤的关键。而头孢曲松等β-内酰胺类抗生素具有杀菌、神经保护等功能，但临床就其对胶质细胞(缺血损伤后促炎性因子生成主要细胞)活化影响等仍无定论。基于此，本次研究以36只成年健康雄性SD大鼠为研究对象，在头孢曲松预处理后建立大脑中动脉阻塞模型(MCAO)，分析神经功能缺陷评分及IL-1β表达变化，以探讨局灶性脑缺血损伤中头孢曲松预处理的作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年8月36只成年健康雄性SD大鼠(购自第四军医大学动物中心)，于12h昼夜循环光照恒温箱内饲养，自由进食、进水7d，体重225～250g，平均体重(236.85±4.11)g。随机分为A组(模型组，n=18)、B组(假手术组，n=18)。A组随机分为A1组(参照，n=9)、A2组(头孢曲松预处理，n=9)。A组体重225～248g，平均体重(232.14±3.54)g；B组体重228～250g，平均体重(241.02±2.89)g。A组与B组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。A1组体重227～248g，平均体重(234.98±3.60)g；A2组体重225～243g，平均体重(230.95±3.75)g。A1组与A2组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器： 试剂包括武汉博士德生物工程有限公司的IL-1β试剂盒、中国天津科密欧公司的多聚甲醛、美国abCAM公司兔抗大鼠OX-42、美国abCAM公司兔抗大鼠GFAP、美国abCAM公司兔抗大鼠IL-1β等。仪器包括日本Acoma麻醉机、西安新光厂的恒温操作台、日本ETHICON尼龙线、中国A36大鼠线栓、瑞典Perimed激光多普勒脑血流监测仪、瑞士metter AE-100电子分析天秤、德国CM1900 Leica冰冻切片机、日本Olympus荧光显微镜、美国伯乐电泳仪等。

1.2.2 给药方法：A1组建立大脑中动脉阻塞模型(MCAO)前5d，以200mg/kg生理盐水腹腔注射，1次/d；A2组建立MCAO模型前5d，以200mg/kg 头孢曲松钠(上海新先锋药业有限公司，国药准字H20023427)腹腔注射，1次/d。B组无任何处理。

1.2.3 建立MCAO模型：A组术前禁食12h，不禁水；10%水合氯醛麻醉，2～3cm切口作于颈部正中，右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉等分离。颈外动脉近心端、颈总动脉近心端结扎。取适量肝素钠溶液，以尼龙栓线头蘸取，插入颈总动脉切口，深度为20mm左右，直至大脑前动脉。静待2h，栓线拔除实现再灌注。B组不插线栓，不引起梗死，其余过程同A组。以大鼠出现同侧Horner征为模型成功。

1.2.4 IL-1β表达检测： 麻醉后，自颈正中偏右切开，多聚甲醛灌流内固定，断头取脑。脱水，石蜡包埋，切片，厚度5μm。行免疫组化SABC法染色，脱腊水化，热修复，封闭以山羊血清；加入一抗(1∶100)、二抗；DAB显色，复染，脱水，透明，封片。取5个高倍镜视野，细胞质内颜色为棕黄色，即为阳性。

1.3 观察指标 (1)观察三组术后24h神经功能缺陷评分[6]，包括自主活动(无活动-0分；几乎无法正常活动-1分；可轻度活动，活动范围在鼠笼3面以内-2分；可自主活动，活动范围超过鼠笼3面-3分)、四肢运动对称性(左侧无活动-0分；左侧存在轻度活动-1分；左侧有活动，且较为缓慢-2分；双侧活动对称-3分)、前肢对称性(左侧前肢无法伸展-0分；左侧前肢可轻度伸展-1分；左侧前肢可伸展，但不如右侧-2分；双侧伸展对称-3分)、攀援能力(无法攀援-1分；左侧稍微弱-2分；可正常攀援-3分)、触须反应(左侧无反应-1分；左侧触须反应减弱-2分；双侧触须反应对称-3分)、双侧躯干反应(左侧无反应-1分；左侧躯干反应减弱-2分；双侧躯干反应对称-3分)6项，总分最高18分。得分越高则神经行为学状况越佳。(2)观察三组缺血半暗带皮层、纹状体IL-1β表达。

2 结果

2.1 神经功能缺陷评分对比 A1组、A2组、B组神经功能缺陷评分分别为(8.30±0.28)分、(12.19±0.35)分、(17.65±0.18)分。其中，A1组、A2组评分低于B组，差异有统计学意义(P<0.01)，但A2组高于A1组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 缺血半暗带皮层、纹状体IL-1β表达比较 A1组、A2组缺血半暗带皮层IL-1β水平均高于B组，差异有统计学意义(P<0.01)，但A2组低于A1组，差异有统计学意义(P<0.01)。A1组、A2组纹状体IL-1β水平均高于B组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1三组IL-1β表达对比

注：*与A2组、B组相比，P<0.01；#与B组相比，P<0.01；&与B组相比，P<0.01。

3 讨论

据调查，缺血再灌注损伤后可引发大量炎性递质高表达，如IL-1β、IL-6等[7-8]。IL-1β为缺血损伤早期所致炎性因子。机体脑缺血再灌注损伤发生早期，可迅速激活胶质细胞，促使大量释放炎性因子IL-1β，直至再灌注22h，脑组织内IL-1β水平增高，介导组织损伤作用[9-10]。故发病早期经有效措施对胶质细胞激活进行抑制，控制炎症反应，减轻脑缺血再灌注损伤至关重要。而β-内酰胺类抗生素具有抗菌、神经保护作用，在中风、脑肿瘤等神经系统病变中发挥重要作用。目前，临床已证实相关动物模型中β-内酰胺类抗生素头孢曲松神经保护作用，考虑作用机制为促使脑内谷氨酸转运体-1表达上调[11]。有研究就该问题进行离体实验，调查发现青霉素、头孢曲松、氨苄青霉素等β-内酰胺类抗生素可激活谷氨酸转运体表达，而非β-内酰胺类抗生素无该作用[12]。有研究同样在人胚胎星形胶质细胞上验证该结论，调查发现谷氨酸转运体-1表达上调呈现剂量依赖性，最佳腹腔注射剂量为200mg/kg，在该剂量基础上加重剂量并不能再促使谷氨酸转运体-1表达上调[13]。谷氨酸转运体-1主要表达于星形胶质细胞[14]。但是，值得注意的是，谷氨酸转运体-1表达上调并非一定受功能激活影响，但头孢菌素确实可促使生化谷氨酸转运增强。而且，头孢曲松预处理能逆转部分炎症因子分泌及释放，减轻炎性反应，但就头孢曲松在大鼠MCAO模型后神经保护作用及机制的研究仍较少。

本次研究中，A组术后24h神经功能缺陷评分较B组降低(P<0.05)，但A2组建模前给予200mg/kg头孢曲松腹腔注射，术后24h神经功能缺陷评分较未注射的A1组更高。提示头孢曲松腹腔注射可在一定程度上纠正神经功能缺陷，与刘畅等[15]结果相符。目前，临床已证实IL-1β的mRNA可在海马、纹状体、大脑皮质、丘脑等部位表达，且机体出现大脑缺血后，可迅速激活，且持续分泌，作用时间可持续到第7天。而本次研究中，相较于B组，A组缺血半暗带皮层、纹状体IL-1β水平均提升，提示存在较严重炎症反应，且炎性因子浸润脑组织介导损伤。此外，值得注意的是，A2组缺血半暗带皮层IL-1β水平较A1组低(P<0.05)，提示相较于A1组，A2组炎症反应相对较轻。考虑与头孢曲松预处理有关，可部分抑制胶质细胞活化，发挥神经保护作用，且能逆转IL-1β合成及分泌，控制炎性反应，减轻脑组织损伤，这可能是其神经元保护的作用机制之一。而纹状体A1组、A2组IL-1β水平差异不显著。故推测逆转区域在缺血半暗带皮层，可减轻炎症反应，是改善神经功能的重要机制。但目前针对头孢曲松如何对胶质细胞产生作用仍无明确定论，需进一步探讨。本次研究局限之处还包括研究指标较为单一，比如未进一步分析对IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性指标的影响，而大脑缺血后也可引发IL-6、TNF-α等递质高表达。故今后仍需加大研究力度，进行更深层次调查分析。

综上所述，头孢曲松预处理在控制大鼠局灶性脑缺血损伤中具有一定作用，可抑制缺血后大鼠脑组织IL-1β表达，经由减轻损伤后炎性反应来保护神经功能，需引起高度关注。