HPLC-DAD-Q-TOF-MS在线筛选鉴定牛蒡中的抗氧化成分

郑振佳，张瑞凌，张敏敏，邱志常，张 斌，乔旭光,*

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东 泰安 271018；2.齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，山东 济南 250014）

牛蒡（Arctium lappa L.）为菊科两年生草本植物，《本草纲目》记载其“久服轻身耐老”[1]，现代研究证明牛蒡具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤、降血糖等活性[2-4]，对高血压、糖尿病、动脉硬化等疾病具有治疗作用[5-7]。牛蒡提取物具有很好的抗氧化作用，可以有效清除自由基、提高超氧化物歧化酶活性、抑制脂质体和蛋白质的氧化损伤并与VE形成协同作用增强抗氧化性[8-13]。牛蒡中具有抗氧化活性的化合物主要为咖啡酰奎宁酸类和黄酮类化合物，其中咖啡酰奎宁酸类化合物的报道远多于黄酮，是牛蒡中主要的次级代谢产物[14-17]。咖啡酰奎宁酸类化合物属于咖啡酸的衍生物，主要存在牛蒡乙酯相中，该化合物具有明显的抗氧化作用[18-19]，对氧化应激引起的缺血性损伤、肝细胞脂质过氧化和胰岛素抵抗等症状具有明显改善作用[20-23]，是牛蒡中最重要的一类活性成分。先前的研究通过高效液相色谱-质谱联用对牛蒡中该成分进行分析[24-25]，分析过程仅依据分子质量进行推断，并未经对照品进行验证，因此鉴定结果的准确性有待于进一步考证。

基于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）模型建立的高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱法已成为天然产物研究中抗氧化活性成分筛选的重要方法之一[26-29]，样品中的抗氧化活性成分与DPPH-甲醇溶液反应后进入紫外检测器，由于自由基的清除导致在517 nm波长处在线检测形成负峰。通过DPPH模型中出现的负吸收峰结合化合物的紫外吸收和精准分子质量，可以快速、定向和准确鉴定样品中的抗氧化成分。

本研究以牛蒡提取物的乙酸乙酯相为研究对象，基于DPPH筛选模型建立高效液相色谱-二极管阵列检测器-串联三重四极杆飞行时间质谱（high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，HPLC-DAD-Q-TOF-MS）在线筛选鉴别自由基清除剂的方法对牛蒡中天然抗氧化活性成分进行快速筛选和鉴定，为食品及中药等复杂体系中抗氧化活性成分的筛选提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛蒡购于江苏沛县轶伟食品有限公司，经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定为菊科植物牛蒡（Arctium lappa L.）的根，品种为柳川理想。

DPPH 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯） 瑞士Oceanpak公司；纯净水 娃哈哈集团有限公司。

1.2 仪器与设备

1260 HPLC仪（配置DAD）、G6520A Q-TOF-MS（配置电子电离源） 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液及DPPH-甲醇溶液制备

牛蒡干燥粉碎后过80 目筛，称取2.0 g牛蒡样品，100 mL 50%乙醇溶液回流提取30 min，抽滤后低压浓缩至无明显醇味后用纯水定容至10 mL，依次用3 倍体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取相蒸干，分别用50%乙腈溶液定容至2 mL，过0.45 μm有机滤膜，备用。

准确称取DPPH标准品，配制成浓度为6×10-5mol/L甲醇溶液，置于4 ℃冰箱中避光保存，现配现用。1.3.2 抗氧化成分在线筛选与鉴别

图 1 抗氧化成分在线筛选与鉴别流程图Fig. 1 Flow chart of on-line screening for and identification of antioxidant compounds

实验流程见图1。待测样品经HPLC-1分离通过经分流阀分成2 部分，一部分进入混合器，与HPLC-2泵入的DPPH-甲醇溶液混合反应后进入DAD，在517 nm波长处形成的负峰即为抗氧化成分；另一部分进入DAD和MS仪，实现各成分的紫外吸收检测以及各成分的在线质谱分析。负峰色谱图结合精准的分子质量信息与紫外吸收特征，实现牛蒡中抗氧化成分的在线快速筛选。

1.3.3 仪器工作条件

HPLC-1工作条件：色谱柱：Phenomenex Gemini-NX C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；乙腈（A）-0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序：0～7 min（15% A），7～8 min（15%～20% A），8～29 min（20% A），29～30 min（20%～25% A），30～50 min（25%～30% A）；流速1 mL/min；检测波长280 nm；进样量10 μL；柱温25 ℃。样品经HPLC-1色谱柱后分流至DAD-Q-TOF-MS流速为0.3 mL/min，另一路液体流速为0.7 mL/min。

HPLC-2工作条件：反应器为PEEK盘管（10 m×0.254 mm）；流动相为DPPH-甲醇溶液，流速0.5 mL/min，检测波长517 nm。

HPLC-1的正峰色谱图和HPLC-2的负峰色谱图由Agilent液相色谱化学工作站同时获得。

质谱工作条件：分别采用电喷雾正、负离子模式；全扫描范围m/z 100～1 000；毛细管电压4.5 kV；雾化气压力35 psi；干燥气流速10.0 L/min；干燥气温度325 ℃；裂解电压100 V；锥孔电压60 V。

2 结果与分析

2.1 牛蒡抗氧化成分提取结果

本实验分别考察50%乙醇溶液超声提取和回流提取2 种方式对牛蒡化学成分的提取效果，结果表明回流提取30 min的效果优于200 W超声提取1.5 h，故采用回流方式进行提取。提取浓缩后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，通过HPLC对牛蒡的不同萃取部位分析比对，结果见图2。石油醚相（图2A）、乙酸乙酯相（图2B）和正丁醇相（图2C）差异较大，说明采用不同极性的溶剂进行萃取富集的前处理过程初步实现牛蒡化学成分的分段富集与净化。从图2可以看出，乙酸乙酯相的HPLC图与回流提取总样最为接近，所以将乙酸乙酯相作为后续的分析对象。

图 2 牛蒡不同相液相色谱图Fig. 2 Chromatograms of different solvent extracts of burdock

2.2 HPLC条件优化结果

分别考察乙腈-0.1%甲酸溶液和甲醇-0.1%甲酸溶液2 种流动相对目标物的分离效果，结果表明，在实现较好分离的目标下，乙腈-0.1%甲酸溶液体系洗脱时间为50 min，甲醇-0.1%甲酸溶液体系洗脱时间为70 min，且前者的分离效果优于后者。在同一HPLC条件和色谱柱规格（250 mm×4.6 mm，5 µm）下，分别考察Phenomenex Gemini-NX C18、YMC-Pack ODS-A、Waters Symmetry C18和Spax Amethyst C18-H四种不同色谱柱对于目标物的分离效果。经实验比较，Phenomenex Gemini-NX C18色谱柱的分离效果最佳，因此选取该色谱柱作为分析色谱柱，样品HPLC分析结果见图3。

图 3 牛蒡提取物HPLC图Fig. 3 HPLC of burdock extract

2.3 抗氧化活性成分在线筛选结果

图 4 牛蒡提取物在线清除自由基HPLC图Fig. 4 HPLC chromatograms of burdock extract and on-line screening for free radical scavengers

DPPH浓度是影响筛选灵敏度的一个重要因素，信噪比随着浓度的增加而相应增加，同时基线噪音和基线波动也随之增大。研究分别考察2×10-4、1×10-5mol/L和6×10-5mol/L三个浓度下的筛选效果，结果表明DPPH-甲醇溶液浓度为6×10-5mol/L时的筛选效果最佳，因此选取该浓度作为筛选浓度，自由基清除剂筛选结果见图4。

2.4 紫外吸收情况考察结果

利用DAD对样品中峰面积相对含量在0.5%以上且具有抗氧化活性的化合物进行全波长扫描，结果见表1。从全波长扫描结果来看，该样品中具有抗氧化活性化合物的紫外吸收情况具有高度相似性，主要成分的紫外吸收最大波长在216、240 nm和320 nm附近，初步判断为结构类似物，且样品中大多数化合物在300 nm波长处有特征肩峰，判定为咖啡酰奎宁酸类系列化合物。

表 1 牛蒡提取物的HPLC-DAD-Q-TOF-MS测量结果Table 1 Analytical data from HPLC-DAD-Q-TOF-MS for burdock extract

2.5 MS条件优化结果

分别考察正离子和负离子模式下待测样品的总离子流图，由图5可以看出，待测组分在负离子模式下响应值优于正离子模式，杂质的干扰程度低于正离子模式，因此选取负离子模式为质谱检测条件。

图 5 正（A）、负（B）离子模式下总离子流图Fig. 5 Total ion current chromatograms of burdock extract in the positive (A) and negative ion (B) modes

2.6 抗氧化成分的Q-TOF-MS鉴别

在优化HPLC条件下，采用Q-TOF-MS技术对目标化合物进行鉴别。根据获得化合物的精确分子质量信息与DAD获得的紫外吸收信息，对相对含量0.5%以上的咖啡酸及其衍生物进行鉴别，结果见表1。参考文献[30-32]并与山东省分析测试中心国家天然产物参比实验室自有的绿原酸、咖啡酸、1,5-O-二咖啡酰奎宁酸、绿原酸甲酯、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸、1,3-O-二咖啡酰奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰-3-O-琥珀酰奎宁酸共9 种对照品进行比对，对照品的色谱峰分别对应图3中的峰1、2、3、4、6、7、8、11和峰12共9 个化合物。峰5、9和峰10分子质量相同，根据极性大小和二咖啡酰奎宁酸的出峰顺序推断峰5为1,5-O-二咖啡酰-3-O-苹果酰奎宁酸，峰9为3,4-O-二咖啡酰-3-O-苹果酰奎宁酸，峰10为3,5-O-二咖啡酰-3-O-苹果酰奎宁酸。峰13分子质量与峰5、峰9和峰10相差14，相差的基团为—CH2—，根据参考文献[33]和已发现化合物的信息推断峰13为1,5-O-二咖啡酰-3-O-苹果酸甲酯奎宁酸。峰15为二咖啡酰奎宁酸甲酯，筛选范围为1,3-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯、3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯、3,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯和4,5-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯中的一种，考虑到成键的顺序和甲酯基团引起的极性差异，推断该化合物为3,4-O-二咖啡酰奎宁酸甲酯。峰14和峰16相对分子质量相差14，相差的基团为—CH2—，从已发现琥珀酸在类似结构中的取代情况推断峰14为1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酰奎宁酸，峰16为1,5-O-二咖啡酰-4-O-琥珀酰甲酯奎宁酸。峰17为三咖啡酰-奎宁酸乙酯，峰18、19分别为三咖啡酰-苹果酰奎宁酸和三咖啡酰-琥珀酰奎宁酸的同分异构体，由于三咖啡酰-奎宁酸化合物目前发现有1,3,5-O-三咖啡酰奎宁酸、1,4,5-O-三咖啡酰奎宁酸和3,4,5-O-三咖啡酰奎宁酸3 种，结构中可结合苹果酸和琥珀酸的羟基较多，难以确定具体结合位点，因此峰17～19只能归属到三咖啡酰奎宁酸类化合物衍生物的范畴。

3 结 论

本研究建立在线筛选鉴定抗氧化活性成分方法，实现牛蒡乙酸乙酯相中抗氧化活性成分的在线筛选与鉴定，结果显示牛蒡中重要的抗氧化成分主要为咖啡酰奎宁酸类化合物。本方法快速、准确，与紫外分光光度计法和传统天然产物中复杂成分的分离与鉴别模式相比，具有更高的筛选效率；与前期的MS鉴定方法比较，新增活性筛查以及采用部分对照品进行确证，从而保证结果更加准确。由于咖啡酰奎宁酸类化合物结构类似且存在多种同分异构体，在无对照品的前提下，即使通过多级质谱也难以实现精准鉴定。对于未明确具体名称的咖啡酰奎宁酸类化合物，需在后期研究中通过多种色谱技术制备获得高纯度单体，结合核磁共振二维谱实现结构确证。