酒花浸膏关键性香气成分分析

王 娟，李 娟，夏艳秋，黄明泉，张璟琳*，孙宝国，张玉玉

（北京工商大学，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，食品质量与安全北京实验室，北京市风味化学重点实验室，北京 100048）

酒花又称啤酒花，是药食同源植物，属大麻科葎草属。我国人工栽培酒花已有五十多年，主要分布于新疆、河北、陕西、四川等地[1]。酒花浸膏是以天然酒花或酒花颗粒为原料，经微波辅助浸提、超临界二氧化碳萃取等方法得到的具有啤酒花香气的金黄色黏稠液体[2-3]。酒花浸膏药用价值与独特的天然香气特征使其在医药、食品、烟草等领域具有广阔的前景和研究价值。国内外对于酒花和酒花浸膏的研究工作主要集中于生产工艺、化学成分的分析、毒理学的研究以及α-酸的测定等方面[4-6]。α-酸是多种结构类似物的混合物，按其侧链的不同，α-酸有5 个同系物：葎草酮、辅葎草酮、加葎草酮、前葎草酮和后葎草酮[6]。中国药典记载酒花的乙醇浸膏可用于治疗肺结核病和麻风病等症[7-8]。Bland等[9]研究表明酒花浸膏中的异葎草酮可改善胰岛素抵抗和血脂异常，同时也可以减少全身性炎症，增加脂肪代谢和降低高脂喂养动物模型中的肥胖。Praet等[10]利用啤酒花提取物作为发酵面包的抗真菌原料。二氧化碳酒花浸膏、异构化浸膏、四氢异构化浸膏的应用，大大改善啤酒花在啤酒酿造中的利用效率，且其中的萜类物质在啤酒发酵过程中通过生物和化学变化生成的其他物质，能极大地影响啤酒的香气类型和强度[11]。

关于酒花中挥发性成分的研究已有一些相关文献报道[12-18]，如Aberl等[12]研究出酒花中酒花油的挥发性成分多达400多种，其主要成分为石竹烯、蛇麻烯及月桂烯。陶鑫凉等[15]通过固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）结合气相色谱-质谱方法定量分析啤酒花中19 种香气成分，19 种化合物回收率为81.2%～116.8%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于9.8%，该方法具有操作简便、样品用量少、灵敏度高等优点。王辉[16]研究酒花品种、新鲜度、配方和工艺对啤酒风味的影响，表明新鲜酒花所酿啤酒风味保鲜期更长。Inui等[17]采用全二维气相色谱-飞行时间质谱（two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry，GC×GC/MS-TOF）联用仪对不同种类酒花进行分析，共得到67 种与酒花风味有明显相关性的化合物。王露等[13]采用同时蒸馏萃取（simultaneous distillation and extraction，SDE）、SPME、水蒸气蒸馏（steam distillation，SD）3 种前处理方法结合气相色谱-嗅闻-质谱（gas chromatographyolfactory-mass spectrometry，GC-O-MS）联用对酒花中香气活性成分进行分析，结果表明SPME法最适合酒花中香气活性成分的萃取，并采用该法对酒花进行GC-O-MS检测，嗅闻得到的重要活性成分有香叶醇、橙花醇、乙酸香叶酯、辛酸甲酯、橙花叔醇、β-石竹烯等。而关于酒花浸膏的香气活性成分分析鲜有报道。

本研究系统分析酒花浸膏中的关键性香气成分，首先采用SPME与溶剂辅助蒸发萃取（solvent-assisted flavor evaporative，SAFE）两种前处理方法分别对酒花浸膏进行GC-MS分析，并结合双色谱柱定性其挥发性成分；再通过GC-O结合香气提取稀释分析（aroma extraction dilution analysis，AEDA）找出香气活性物质；然后，对风味稀释（flavor dilution，FD）因子较大的进行定量分析，计算其香气活性值（odor activity value，OAV）；最后，综合AEDA和OAV结果确定酒花浸膏的关键性风味化合物。本研究有助于揭示酒花浸膏中香味成分的化学本质，可为其质量标准的修订和完善提供参考数据，促进其在香精香料中的进一步应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒花浸膏（乙醇浸提，批号20140223，含水量3.64%，水溶物含量230 mg/g，醇溶物含量750 mg/g）杭州西湖香精香料有限公司；乙醚（重蒸）、正戊烷（重蒸）、无水硫酸钠、无水乙醇（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司。

异戊酸己酯（内标）、正构烷烃（C6～C30）、乙酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯、戊酸乙酯、异己酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、戊二酸二乙酯、壬酸乙酯、癸酸甲酯、邻氨基苯甲酸甲酯、(E)-4-癸烯酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、DL-2-羟基-4-甲基戊酸乙酯、亚麻酸乙酯、乙醇、异戊烯醇、苯甲醇、丙酮、2-十一酮、2-十二酮、2-十三酮、异丁酸、异戊酸、己酸、(E)-石竹烯、十三烷、2-乙酰基吡咯（均为色谱纯，纯度＞95%） 百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

T-403电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；EF9697 Pipetman M精密移液器 法国Gilson公司；TRACE ULTRA-DSQII和TRACE1310-ISQ LT GC-MS联用仪 美国Thermo Fisher公司；ODP3嗅闻检测仪 德国Gerstel公司；SPME进样手柄、SPME萃取头（灰色）50/30 μm DVB/CAR/PDMS 美国Supelco公司；BF-2000氮气吹干仪 北京八方世纪科技有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

1.3.1.1 SPME

将50/30 μm灰色萃取头（DVB/CAR/PDMS）在GC进样口老化时间30 min，老化温度250 ℃。称取（1.000±0.002）g样品置于20 mL样品瓶中，在50 ℃水浴锅中平衡30 min，插入活化好的萃取头顶空萃取50 min，拔出萃取头插入到GC-MS联机的进样口，在250 ℃解吸3.0 min[19]。

1.3.1.2 SAFE

称取（2.000±0.002）g样品浸膏置于锥形瓶中，加入质量浓度为4.27 mg/mL的异戊酸己酯250 μL作为内标，再加入200 mL体积比为1∶1的乙醚和正戊烷混合溶液，超声30 min，经过滤去除不溶物得到萃取液。将该萃取液置于SAFE装置的滴液漏斗中，并在冷阱中加入液氮，将循环水和水浴的水温设为40 ℃，当系统真空度达到1×10-6MPa时，缓慢打开滴液漏斗旋塞，在萃取过程中保持样品匀速滴下[20]。萃取完后，向萃取液中加入无水硫酸钠置于4 ℃冰箱中12 h，过滤后通过旋转蒸发仪浓缩至2.0 mL，待GC-MS分析。以上实验重复3 次。

1.3.2 GC-MS分析

GC条件：TRACE1310-ISQ LT：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初温40 ℃，以3 ℃/min升至100 ℃，保持10 min；再以6 ℃/min升至150 ℃，保持8 min；最后以20 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。载气He，纯度99.999%，流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；分流比100∶1（SPME法：无溶剂延迟；SAFE法：进样量1.0 μL，溶剂延迟3.0 min）。TRACE ULTRA-DSQII：TG-WAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初温40 ℃，以3 ℃/min升至100 ℃，保持5 min；再以4 ℃/min升至130 ℃，保持10 min；再以20 ℃/min升至230 ℃，保持20 min；其他条件同上。

MS条件：电子电离源，电子能量70 eV，离子源温度250 ℃，传输线温度280 ℃，质量扫描范围m/z 35～450，全扫描。

GC-MS条件：GC与TRACE1310-ISQ LT MS条件相同；进样量1.0 μL，样品经进样口解吸后，经GC色谱柱分离后，分别进入火焰离子检测器和嗅闻检测器，分流比为1∶1；嗅闻仪条件：接口温度200 ℃，传输线温度250 ℃，氮气输出流量15 mL/min。

1.3.3 化合物鉴定

1.3.3.1 定性分析

采用NIST14谱库检索、标准品比对，并结合保留指数（retention index，RI）进行定性。

RI定性：在相同色谱条件下，分别将样品与正构烷烃（C6～C30）前后进样进行分析，通过计算公式（1）计算RI，并与文献中报道的RI对比，将绝对值相差10以内的确定为同一化合物。

式中：n和n+1分别为未知化合物流出前后正构烷烃碳原子数；t为未知化合物保留时间；tn和tn+1为相应正构烷烃的保留时间（tn＜t＜tn+1）。

1.3.3.2 GC-O/AEDA分析

采用GC-O结合AEDA对酒花浸膏中的香气活性成分进行分析。将样品经SAFE浓缩液用乙醚和正戊烷1∶1的混合液按照3n逐级进行稀释，取稀释后浓缩液1 μL进GC-O分析，3 位评价人员记录在嗅闻口所闻到的香味特征和保留时间，直到嗅闻评价人员在嗅闻端嗅闻不到气味。FD因子为3 个评价员嗅闻到的最大稀释倍数。1.3.3.3 OAV的计算

对FD因子较大的香气活性化合物定量分析，并计算其OAV。

定量分析：标准溶液配制：用无水乙醇将各标准品配制成单标，然后依次配制成5 个不同质量浓度的混标；标准曲线绘制：取上述配制的5 个不同质量浓度的混标，加入相同质量浓度的内标，分别按照SAFE方法进行萃取，最后定容至2.0 mL。以待定量化合物与对应内标化合物质量浓度之比为横坐标，以待定量化合物与内标化合物峰面积之比为纵坐标，建立标准曲线，计算样品中香味活性成分含量。OAV按式（2）计算：

式中：Ci为化合物含量/（μg/kg）；OTi为该化合物在水中的阈值/（μg/kg）。

1.4 数据处理

采用Excel 2010软件计算7 种重要香气化合物含量，以 ±s表示。

2 结果与分析

2.1 酒花浸膏挥发性成分分析

表 1 酒花浸膏中挥发性成分GC-MS分析结果Table 1 Volatile compounds in hops extracts as analyzed by GC-MS

续表1

续表1

由表1可知，通过NIST谱库检索、保留指数对比及标准品比较共同鉴定出111 种挥发性物质，其中酯类化合物50 种，萜烯类化合物14 种，酸类11 种，酮类11 种，醇类10 种，酚类1 种，吡嗪、吡咯等杂环类化合物5 种，其他类9 种。

由表1可知，SPME法鉴定出酒花浸膏的挥发性化合物70 种：酯类37 种，醇类4 种，酮类7种，酸类5 种，萜烯类13 种，酚类1 种，杂环类3 种。SAFE法鉴定酒花浸膏的挥发性化合物86 种：酯类41 种，醇类9 种，酮类8 种，酸类9 种，萜烯类7 种，杂环类3 种，其他类化合物9 种。SPME法萃取较多易挥发的小分子物质，SAFE萃取出更多如硬脂酸乙酯、亚麻酸乙酯等链长较SPME挥发程度低的物质。这是因为SAFE是在高真空、较低温度条件下提取挥发性成分的方法，利用溶剂在低温和高真空条件下迅速汽化，辅助目标香气物质蒸发，除去难挥发物质，使萃取物表现出样品原有的自然香味，但操作过程中容易损失易挥发类物质[20]。而SPME是萃取头的选择性吸附，更易萃取出易挥发的物质，对高沸点长链化合物的萃取效果则较差[21]。可见，2 种萃取方式结合能鉴定出酒花浸膏中更多的挥发性成分。

对不同色谱柱的对比分析可知，在GC-MS双柱定性共鉴定出的111 种化合物中，HP-5MS、TG-WAX分别鉴定出90 种和73 种挥发性化合物，共同鉴定出的化合物有52 种。除酯类和醇类外，经HP-5MS弱极性柱分离鉴定出的酮、酸、萜烯、杂环类和其他类化合物种类数量明显多于TG-WAX极性柱。可见，2 种色谱柱分离鉴定的化合物种类有明显差异，同时采用2 种不同类型的色谱柱（强极性和弱极性）对酒花浸膏进行双柱定性，避免仅一类色谱柱的分离局限性，使挥发性物质的鉴定更加准确和全面[22]。

酒花浸膏中挥发性成分中有42 种化合物在酒花的相关研究中被报道过[12,14-18,23-36]，其余69 种未见报道。酯类物质最多，其次是萜烯类物质。在王露等[13]研究中，萜烯类、酯类也是酒花的主要挥发性成分，这与本研究结果一致。酯类化合物中大多数是低级脂肪酸与脂肪醇生成的具有果香味的酯，如庚酸乙酯、辛酸乙酯等；还有少量芳香族醇的酯类、不饱和烃类羧酸酯、内酯。质量分数较高的有4,4-二甲基-2-丁烯-4-内酯（4.92%～11.13%）、异戊酸乙酯（5.39%～8.35%）、甲基琥珀酸二乙酯（1.45%～5.18%）、(E)-4-癸烯酸乙酯（1.22%～9.77%）、癸酸乙酯（0.57%～5.05%）。甲基琥珀酸乙酯、戊二酸二乙酯、(E)-4-癸烯酸乙酯等化合物是萜烯类氧化物，可能来源于酒花中萜烯化合物的氧化反应。同时，另一些乙酯类化合物，如十一酸乙酯、DL-苹果酸二乙酯、亚麻酸乙酯等，可能是在加工过程中因与浸提溶剂（乙醇）发生反应而产生。萜烯类化合物是广泛存在于自然界的一种次生代谢产物，可呈现令人愉快的特殊香气，在植物中，单萜类化合物和倍半萜类化合物是通过1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸途径产生的[33]。酒花浸膏中的β-石竹烯、氧化石竹烯、α-蒎烯、芹子烯、α-衣兰油烯、杜松烯等化合物已在酒花相关文献中被报道过[22-25]。石竹烯及其氧化物是酒花中的重要物质，本研究检测到其他酒花相关文献中未报道过的6 种萜烯类化合物：巴伦西亚橘烯、ç-木罗烯、B-瑟林烯、佛术烯、去氢白菖烯、A-二去氢菖蒲烯。这些物质可能来源于酒花中萜烯类化合物的重排[24]。

酒花浸膏中检测到的酮类物质中2-十一酮、2-十三酮、丙酮、4-甲基-2-戊酮、2-十二酮5 种化合物已有相关文献报道。其次，还检测到酒花中目前未见报道的6 种酮类：2-戊酮、3,3,6-三甲基-4,5-庚二烯-2-酮、3-羟基-3-甲基-2-丁酮、5,5-二甲基-二氢-呋喃-2-酮、环十二酮、3-甲氧基-5-甲基-2-环戊烯-1-酮。酸类物质中，酒花浸膏检测到目前未报道过的异丁酸、3,3-二甲基丙烯酸和2-羟基异丁酸3 种物质。还检测到4 种含氮类杂环化合物和1 种物质吡咯物质，分别为2,5-二甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、4,5-二甲基噻唑、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯。吡嗪、吡咯等杂环化合物是植物体内重要的化学成分，如植物绿色素分子中都含有杂环化合物[37]。

2.2 关键性风味成分的确定

表 2 酒花浸膏风味化合物分析结果Table 2 AEDA results of hops extracts

由表2可知，采用SAFE提取酒花浸膏所鉴定出的化合物更多，且对SAFE法萃取得到的浓缩液进行3n等比例稀释更加简便、精确。因此，本研究用SAFE法萃取酒花浸膏得到的浓缩液进行GC-O/AEDA嗅闻分析，再对GC-O嗅闻出的对香气贡献较大物质进行定量并计算其OAV，结果如表2、3所示。

表 3 重要风味化合物定量分析结果Table 3 Quantitative analysis of important flavor compounds in hops extracts

GC-O共检测到27 种香气活性成分：酯类18 种，酸类3 种，酮类2 种，醇类1 种，萜烯类1 种，未知化合物2 种。根据嗅闻结果，酒花浸膏的香气成分主要为果香、花香、酒香、药草香、辛辣味、酸味，其次还有芳香、甜味、鸢尾香、皂香等较弱香气。刘霞[42]、全巧玲等[43]将酒花主要香气描述为花香、水果香、松脂香、辛辣、苦味。酒花浸膏主要香气特征与其相似，但由于浸膏是经过酒花提取物，香气存在差异。在浸膏提取过程中所含与苦味、松脂味相关的化合物含量减少或其成分被破坏，所以在酒花浸膏中没有检测到呈苦味、松脂香的化合物。

酒花浸膏的香气活性成分中以酯类物质含量最多，为酒花浸膏贡献果香和花香，还有酒香、草香、甜味等。异丁酸乙酯、异己酸乙酯等呈果香，癸酸乙酯、异戊酸乙酯等呈酒香，辛酸乙酯、丙二酸二乙酯呈花香和芳香，苯乙酸乙酯呈蜂蜜甜味，DL-苹果酸二乙酯、十四酸乙酯等除果香外，还贡献药草香和温和的皂香，壬酸乙酯呈坚果味。这些酯类物质中FD因子较大的香气成分有异丁酸乙酯（FD=243，果香）、异己酸乙酯（FD=243，果香）、辛酸乙酯（FD=243，果香、花香）、癸酸乙酯（FD=243，果香、发酵酒香）、丁二酸二乙酯（FD=81，令人愉悦的香气）、苯乙酸乙酯（FD=81，蜂蜜甜）6 种化合物，且大多为乙酯类，这类物质使得酒花浸膏的果香、花香、酒香更加醇厚饱满。酸类化合物主要在酒花浸膏中贡献辛辣味和酸味，2-甲基丁酸（FD=729）在高浓度时呈辛辣、刺鼻味，稀释过后有令人愉快的果味，对酒花浸膏香气贡献较大；4-甲基戊酸呈酸臭、刺鼻味，辛酸呈微弱的果味与轻微的酸味，仅能在原样中闻到。酮类、萜烯类、醇类对酒花浸膏香气贡献作用较小。酮类化合物中2-十三酮呈坚果香和药草香，2-十一酮呈芸香。李祖光等[44]研究表明2-十三酮、2-十一酮也是紫藤花中重要的香气物质。萜烯类和醇类仅嗅闻到呈绿茶味、怪味的氧化石竹烯和芳香味的苯甲醇，这可能由于这些化合物阈值较高，在酒花浸膏中的含量低于阈值。

阈值评估和AEDA方法是识别食物中香味活性化合物的广泛应用技术[45]，本研究计算OAV以进一步补充和支持这些香味活性化合物对酒花浸膏整体香气的贡献。通过对FD不小于81的各香气活性成分进行定量并计算其OAV，可知，含量由高到低依次为异丁酸乙酯（566.13 mg/kg，OAV=566 000）、丁二酸二乙酯（517.46 mg/kg，OAV＜1）、2-甲基丁酸（176.330 mg/kg，OAV=2 939）、异己酸乙酯（123.07 mg/kg，OAV=41 023）、辛酸乙酯（110.610 mg/kg，OAV=22 122）、苯乙酸乙酯（42.73 mg/kg，OAV=65）、癸酸乙酯（35.55 mg/kg，OAV=4 444），这7 种化合物中丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯由于阈值较大，OAV值较低，其他5 种化合物OAV都大于1 000。综上，筛选出酒花浸膏中的关键性香气成分为异丁酸乙酯、2-甲基丁酸、异己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯这5 种物质。

3 结 论

采用SPME和SAFE两种前处理方法，结合GC-MS对酒花浸膏的挥发性成分进行分析，定性出111 种挥发性物质，首次报道69 种。经GC-O/AEDA对酒花浸膏中的香味活性成分分析，共检测到包括酯类、酸类、酮类、醇类、萜烯类的27 种香气物质，FD因子不小于81的香气活性物质有7 种，对其进行定量并计算OAV，异丁酸乙酯含量最高。结合FD因子和OAV分析，最终确认酒花浸膏的关键香气成分为异丁酸乙酯、2-甲基丁酸、异己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯这5 种化合物。