人参皂苷Rb1对小鼠非酒精性脂肪肝病的治疗作用及其机制

韩晓春，张峰，刘长虹，张怀凤，顾良臻，刘雅楠，封俊辰，杨哲

(1山东中医药大学，济南250355；2山东中医药大学附属医院；3山东省千佛山医院)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)全球发病率高达25%[1]，也是我国第二大类慢性肝病[2]，严重影响生命健康。目前临床治疗NAFLD多以降脂、增强胰岛素敏感性和肝脏保护为主，缺乏针对性的治疗药物[3,4]。祖国医学对NAFLD治疗积累了丰富的经验，认为NAFLD病机与肝失疏泄、脾失健运有关，治疗当以除邪补虚、益气健脾为宜。人参可补虚扶正，顺应肝气运化，起到治疗NAFLD的效果，但其具体作用成分及药效缺乏实验验证。2018年3～8月，本研究构建了NAFLD小鼠模型，观察人参皂苷Rb1的治疗作用，以期丰富NAFLD治疗药物种类，为NAFLD治疗提供新的切入点。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康C57BL/6小鼠40只[济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK(鲁)2014-0007]，6周龄，雄性，体质量20～25 g，SPF级环境喂养，温度25 ℃，湿度50%～70%。

1.2 NAFLD模型制作及Rb1给药方法 40只小鼠适应性饲养1周后，按照体质量随机分为模型组30只、正常对照组10只。对照组给予MCS饲料(即蛋氨酸、胆碱完全正常的饲料)喂养，模型组给予MCD饲料(蛋氨酸、胆碱联合缺乏饲料)喂养制作NAFLD模型[5,6]，饲养周期为4周。造模成功后对模型组小鼠进一步随机分组，分为模型对照组、高剂量组和低剂量组，每组10只。参考《中华人民共和国药典》(2015)，高剂量组和低剂量组小鼠分别通过灌胃给予80、40 mg/(kg·d)的Rb1，给药体积为0.5 mL/kg，1次/d，连续给药15 d。

1.3 小鼠体质量、肝脏质量、脾脏质量检测 实验过程中记录小鼠体质量变化，给药15 d后处死小鼠，摘取肝脏、脾脏称重，计算肝脏系数、脾脏系数。

1.4 肝功能检测 小鼠处死后，腹主动脉取血，肝素抗凝，离心后收集血浆，采用生化分析仪(日立7600)检测血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。

1.5 血脂检测 采用生化分析仪(日立7600)检测各组小鼠血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。

1.6 肝组织病理检查 小鼠处死后摘除肝脏，用生理盐水稍作冲洗后以4%多聚甲醛固定，浸蜡，脱水，透明，浸蜡，包埋后切为4～8 μm的薄片，HE染色，镜下观察肝脏组织病理变化。

1.7 肝组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)检测 小鼠处死后，迅速取出肝脏，冰上研磨后离心，取上清液，采用ELISA法检测MDA、SOD。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量及肝、脾质量比较 模型对照组、低剂量组、高剂量组小鼠体质量、肝质量、脾质量和脾脏系数均低于正常对照组(P均<0.01)。见表1。

表1 各组小鼠体质量及肝、脾质量比较

注：与正常对照组相比，*P<0.01。

2.2 各组小鼠血浆ALT、AST水平比较 模型对照组、低剂量组、高剂量组血浆ALT、AST水平均高于正常对照组(P均<0.01)，高剂量组血浆ALT、AST水平低于模型对照组和低剂量组(P均<0.05)，低剂量组血浆AST水平低于模型对照组(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血浆ALT、AST水平比较

注：与正常对照组相比，**P<0.01；与模型对照组相比，△P<0.05，△△P<0.01；与低剂量组相比，▽P<0.05，▽▽P<0.01。

2.3 各组小鼠TC、TG水平比较 模型对照组、低剂量组、高剂量组TC、TG水平均低于正常对照组(P均<0.05)；高剂量组TC水平高于模型对照组，TG水平高于低剂量组(P均<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠TC、TG水平比较

注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组相比，△P<0.05；与低剂量组相比，▽P<0.05。

2.4 各组小鼠肝组织病理变化 正常对照组小鼠肝细胞无明显病变，无脂肪变性，肝小叶结构完整，细胞索排列整齐，血管周围未见炎细胞浸润。模型对照组肝细胞内可见大量脂肪变性，胞质内充满大小不一的脂滴，肝小叶内可见炎细胞浸润；低剂量组和高剂量组脂肪变性均有所减轻，脂滴大小不一，其中高剂量组血管周围炎细胞浸润程度明显好转。见图1。

图1 各组小鼠肝组织病理变化(HE染色)

2.5 各组小鼠肝组织中MDA、SOD表达比较 模型对照组、低剂量组、高剂量组小鼠肝组织中MDA、SOD表达均高于正常对照组，高剂量组肝组织中MDA表达低于模型对照组和低剂量组，低剂量组、高剂量组肝组织中SOD表达均低于模型对照组(P均<0.01)。见表4。

表4 各组小鼠肝组织中MDA、SOD表达比较

注：与正常对照组相比，*P<0.01；与模型对照组相比，△P<0.01；与低剂量组相比，▽P<0.01。

3 讨论

NAFLD是临床常见疾病，其发生往往伴有其他代谢性疾病，如肥胖、血脂紊乱、高血压、2型糖尿病(T2DM)等[7,8]。虽然许多学者认为NAFLD为良性病变，但流行病学调查[9,10]显示有10%～20%的患者最后可发展为肝硬化，其中28%的肝硬化患者会发展成肝细胞癌乃至肝衰竭，1.7%死于肝硬化并发症。目前NAFLD发病率呈现上升趋势，但其机制不明确，也缺乏有效的防治药物。

中医经典文献中无“脂肪肝”定义，但根据其临床表现，常将其归属为“积聚”“胁痛”“痞满”等范畴。中国中医研究院朱振红等[11]根据《难经·第五十六难》中“肝之积，名曰肥气，在左胁下，如覆杯，有头足”，以肝积论之。中医理论认为，此病病位在肝，与脾、胃、肾关系密切。痰浊久聚为标，肝、脾、肾亏虚为本，本虚标实证居多。脾主运化，脾虚则运化痰浊乏力，痰湿久聚成积，积聚亦阻碍气机，加重积聚。人参甘，微温，归脾、肺、心、肾经，为后天补脾益气之要药。脾健则水湿得运，气旺则痰浊得行。除化痰湿积聚之标外，人参亦可补肝肾虚之本，标本兼顾，配以疏肝行气之品则效果益著。

近年来研究发现,人参提取物人参皂苷对酒精性脂肪肝和NAFLD均具有治疗作用。有学者[12]以人参花提取物治疗酒精性脂肪肝大鼠模型，发现治疗组血清TC、TG水平明显降低。陈静等[13]在油酸诱导HepG2细胞脂肪变模型中发现，人参皂苷Rb1能够显著降低TG含量，减轻胞内脂质堆积。彭璇等[14]发现，人参皂苷Rb1可减轻高脂饮食诱导的NAFLD大鼠模型的脂肪肝浸润现象，低剂量(5 mg/kg)即出现脂肪颗粒明显减少，高剂量组(20 mg/kg)则完全看不到脂滴。这种作用与Rb1改善肝脏脂酰CoA合成酶1(CoASH1)、肉毒碱脂酰转移酶I(CATI)、脂酰CoA氧化酶1(ACOX1)等β-氧化相关酶的功能相关。有学者[15]在高脂饮食诱导的肥胖大鼠模型中也发现，Rb1能够显著降低肝组织中TG含量，减轻肝脏质量，其作用机制与腺苷酸活化蛋白激酶的激活有关。

本研究结果也显示，Rb1对MCD诱导的小鼠NAFLD模型具有显著治疗作用。它可以保护C57BL/6小鼠肝功能，并在一定程度上调节血脂变化。从病理切片上看，Rb1可明显减少肝细胞内脂肪蓄积，减轻炎细胞浸润和坏死，缓解NAFLD病情。为研究其治疗机制，我们检测了小鼠肝组织中的MDA和SOD，结果显示，Rb1能够明显减轻NAFLD小鼠肝脏过氧化程度，具有明显的抗氧化作用，且高剂量组[80 mg/(kg·d)]效果更为显著。

氧化应激和脂质过氧化是NAFLD发病的重要机制之一[16]。TG等在肝脏蓄积，本身及其代谢产物可导致线粒体内质网代谢压力增高，引起活性氧簇(ROS)募集，并进一步诱导炎症反应，同时导致脂质过氧化的发生。SOD是机体清除ROS的重要介质，MDA则是ROS作用的终产物。MCD诱导小鼠出现SOD、MDA增高也进一步证明NAFLD存在氧化应激失衡和脂质过氧化[17,18]。Rb1能够降低SOD、MDA含量，发挥抗氧化作用，进而起到治疗NAFLD的效果。

MCD饲料是胆碱、蛋氨酸联合缺乏的饲料，通过人为引起小鼠脂肪酸代谢障碍，诱导肝细胞脂肪变。该造模方法可导致小鼠体质量下降，与人类NAFLD发病过程并不完全一致。但由于MCD喂养小鼠早期即可出现肝细胞脂肪变性，有明显的气球样变特征，非常类似人类NAFLD表现，因此国际上仍将此法作为公认的NAFLD动物模型制作方法[19,20]。在本研究基础上，我们计划开展Rb1作用于高糖高脂小鼠的效果研究，以进行重复性验证。

综上所述，Rb1能够减轻NAFLD小鼠肝脏过氧化程度，减少肝脏脂肪堆积，改善肝功能，并在一定程度上调节血脂，起到治疗NAFLD的作用。本研究结果提示Rb1很可能成为治疗NAFLD的理想药物，这对丰富NAFLD药物种类、改善NAFLD治疗效果都具有重要意义。