IL-28B基因单核苷酸多态性及基因表达水平与宫颈癌的关系

李雯，甄洁玉，周利军，苟元凤，韩雪，刘会玲

(1甘肃省人民医院，兰州730000；2甘肃中医药大学临床医学院)

宫颈癌是女性仅次于乳腺癌的常见恶性肿瘤，据WHO统计2012年全球宫颈癌新发病例约52.8万例，年死亡病例数达26.6万，其中85%以上发生于发展中国家。我国每年新发病例超过13万，占世界宫颈癌新发病例的1/4，严重威胁妇女健康[1]。研究认为，肿瘤免疫微环境改变在肿瘤的发生发展、转移中具有重要作用。白细胞介素28B(IL-28B)属于Ⅲ型干扰素(IFN-λs)家族，可通过上调干扰素的表达从而发挥抗病毒、抑制肿瘤细胞生长以及调节免疫等生物学功能[2]。IL-28B的受体由IFN-λR1(IL-28Rα)和IL-10R2组成，其中IL-28Rα是组织特异性的，使机体不易产生耐受并降低其不良反应，因此有望成为新的临床抗病毒药物。新近的国内外报道显示，IL-28B基因单核苷酸多态性(SNP)与肝癌[3]、非小细胞肺癌[4]、食管癌[5]等肿瘤的发生和进展密切相关，但是IL-28B与宫颈癌的关系鲜有报道。2017年1月1日～2018年1月31日，我们采用PCR技术扩增血液IL-28B(rs12979860、rs8099917)的特异性片段，扩增产物直接测序分析其基因型、等位基因频率，并应用RT-qPCR法观察宫颈癌患者外周血IL-28B mRNA水平变化，探讨其在宫颈癌发生发展中的意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 抽取同期就诊于甘肃省人民医院妇科的患者。纳入标准：①低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、高级别鳞状上皮内病变(HSIL)患者为宫颈锥切术后患者；②宫颈癌术前患者为初诊未治者，在取得血标本前均未接受手术或放化疗等治疗；③宫颈癌术后患者为行宫颈癌手术治疗者；④患者均经2名以上有经验的病理科医师确诊；⑤均为汉族。排除标准：①合并乙型肝炎、丙型肝炎、HIV等传染性疾病或肝癌；②合并自身免疫性疾病或正接受免疫抑制治疗者；③合并尖锐湿疣；④合并子宫其他恶性肿瘤，如子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤等。共收集LSIL(LSIL组)、HSIL(HSIL组)患者及宫颈癌术前(术前组)、术后患者(术后组)各30例，LSIL组年龄(44.45±10.77)岁，HSIL组年龄(50.14±9.34)岁；宫颈癌患者中，术前组年龄(54.70±8.518)岁、淋巴结转移14例，术后组年龄(52.56±9.41)岁、淋巴结转移9例；选择同期成年体检健康女性30例作为对照组，年龄(52.56±9.41)岁，均为汉族。各组年龄、民族具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 标收集本 采集所有受试者清晨空腹血3 mL，并用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，2 h内离心分装。

1.2.2 外周血IL-28B基因多态性检测 应用DNA提取试剂盒(北京全式金生物公司)进行全血DNA提取，-20 ℃保存。用Primer Premier软件设计rs12979860、rs8099917位点上下游引物，由华大基因合成。rs12979860上游引物5′-ATTCCTGGACGTGGATGGGTAC-3′，下游引物为5′-AGCGCGGAGTGCAATTCA-3′；rs8099917上游引物为5′-TTGTCACTGTTCCTCCTTTTGTTT-3′，下游引物为5′-TGGGAGAATGCAAATGAGAGATA-3′。对rs12979860、rs8099917位点DNA片段进行特异性PCR扩增，扩增体系25 μL：PFU酶0.5 μL，10 Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。rs12979860位点反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 7 min；rs8099917位点反应条件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 7 min。IL-28B rs12979860位点PCR产物大小为330 bp，rs8099917位点PCR产物大小为460 bp。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，直接送基因公司进行测序，应用Bio-Rad CFX Manager软件分析各位点基因型。

1.2.3 外周血IL-28B mRNA检测 采用RT-qPCR法。通过Primer Premier软件设计IL-28B、内参基因GADPH引物序列，由华大基因合成。IL-28B上游引物为5′-GTGCAGTTCCCACCTCATCT-3′，下游引物为5′-CTGTGGCCTGAAGCTGTGTA-3′；GADPH上游引物为5′-GTGCAGTTCCCACCTCATCT-3′，下游引物为5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。TRIzol法提取血液总RNA，取约1 μg总RNA，按照TaKaRa公司逆转录试剂盒说明书进行逆转录；反转录获取cDNA后，进行qPCR反应。反应体系(25 μL)：cDNA 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL， SYBR Premix EX Taq 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，(95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)35个循环。以GADPH作为内参，用2-ΔΔCt计算IL-28B mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 各组IL-28B rs1979860、rs8099917位点基因型和等位基因分布情况 多态性位点进行哈迪温伯格平衡检验，符合H-W遗传平衡(χ2=2.842，P=0.596)。IL-28B rs12979860、rs8099917位点基因型、基因频率在各组间分布差异无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 各组IL-28B rs1979860、rs8099917位点基因型和等位基因分布情况(例)

2.2 各组外周血IL-28B mRNA水平比较 LSIL组、HSIL组、术前组、术后组外周血IL-28B mRNA水平依次为99.23±11.67、78.87±21.97、20.90±8.89、192.34±22.65，均低于对照组的308.56±34.55(P均<0.01)。LSIL组外周血IL-28B mRNA高于HSIL组(t=2.728，P=0.011)，HSIL组外周血IL-28B高于术前组(t=12.995，P=0.001)，而术后组外周血IL-28B高于术前组(t=38.591，P=0.001)。

2.3 外周血IL-28B mRNA水平与宫颈癌淋巴结转移的关系 宫颈癌患者中，术前组无淋巴结转移患者外周血IL-28B mRNA水平为26.62±7.07，高于淋巴结转移患者的14.37±5.68(t=5.18，P=0.001)；术后组无淋巴结转移患者外周血IL-28B mRNA水平为199.64±22.88，高于淋巴结转移患者的175.30±9.15(t=3.061，P=0.005)。

3 讨论

研究发现，IL-28B rs12979860 TT基因型增加病毒相关性肝癌、肝硬化的发病[6]，CC基因型可作为抗病毒治疗高应答率的预测因素[7]。rs8099917位点多态性与丙型肝炎病毒(HCV)感染易感性相关，G为HCV感染的风险等位基因[8]。rs12979860位点CC型可作为抗病毒治疗高应答率的预测因素[9]。另外，有文献报道，IL-28B基因多态性与肾细胞癌的疾病进展相关[10]。本研究发现，rs12979860位点基因型分布以纯合子CC为主，其次为CT/TT基因型；而rs8099917位点的基因型分布以纯合子TT为主，其次为TG/GG基因型，这与文献报道基本相符[11]。但是，组间比较发现含有突变位点基因型(T/C、T/G)并未增加宫颈疾病的发病风险，说明IL-28B的多态性位点rs12979860、rs8099917可能与宫颈癌无明显相关性。

研究显示，肝癌中存在IL-28B差异表达的现象[12,13]。Srinidhi等[14]研究发现，HIV感染者IL-28B表达较健康人群显著降低，而经过6～9个月抗病毒治疗后，IL-28B表达显著增加。本研究发现，外周血IL-28B mRNA水平在LSIL组、HSIL组、术前组、术后组均不同程度低于健康对照组，且宫颈癌术后组较术前组IL-28B mRNA明显回升，意味着IL-28B在宫颈疾病中可能是一个保护性因子。研究表明，Tregs可抑制机体免疫应答从而导致肿瘤细胞免疫逃逸。本实验室前期通过构建U14宫颈癌细胞小鼠(Babl/C和c57bl/6j)皮下移植瘤模型，发现腺病毒载体介导的IL-28B(Ad-mIL-28B)能抑制小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤的瘤体生长和肿瘤在肝、肺中的转移、降低小鼠脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞的比例。因此，推测Ad-mIL-28B可能通过降低CD4+CD25+Foxp3+Tregs比例从而发挥抑制U14宫颈癌细胞生长的抗肿瘤作用[15]。张冬红[16]在对HeLa宫颈癌细胞的实验中，再次验证了IL-28B的抗肿瘤作用。韩雪等[17]通过流式细胞仪技术检测22例宫颈癌术前患者、24例宫颈癌术后患者及29例健康对照者的外周血标本，发现宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的细胞数量增加。本实验研究发现，IL-28B mRNA在宫颈癌患者外周血中呈低水平。结合上述的文献报道，我们推测宫颈癌可能与机体IL-28B表达量不足或功能缺陷导致Tregs等细胞引起的机体免疫抑制相关。

宫颈癌盆腔淋巴结转移与否，被认为是影响术后疗效的关键因素[18]。本研究发现，在宫颈癌患者中，术前组、术后组外周血IL-28B mRNA水平在无淋巴结转移组高于淋巴结转移组，提示IL-28B的表达在宫颈癌的疾病发展甚至肿瘤转移中可能发挥重要作用。这与相关动物实验结果基本一致[15,16]。

本研究发现，外周血IL-28B mRNA水平在宫颈癌术前组最低，在HSIL组、LSIL组中次低，而宫颈癌术后组虽仍低于健康对照组，但存在一定程度的回升，可见IL-28B可能在同一疾病的不同阶段存在差异表达。这与谭超月等[19]对宫颈病变患者血清、阴道灌洗液中细胞因子表达的研究结果基本一致。Apostolou等[20]在对干燥综合征的研究中发现，小涎腺腺体组织中IL-28A、IL-28B的免疫组化着色高于对照组织，尤其是中度病变的患者，但重度病变患者IL-28A、IL-28B的表达反而低于中度病变者。郑金旭等[21]、范利娟等[22]通过构造肺纤维化小鼠模型，并于造模后第7、14、21、28天分别检测肺组织中IL-28B的表达；实验发现，给药后第14天出现IL-28B的表达高峰后逐渐下降，给药第28天后表达水平与对照组比较无明显差异，表明IL-28B在肺纤维化的损伤的进程中仅在早期病变中高表达。本研究发现，IL-28B mRNA在宫颈疾病中的这种差异表达，提示IL-28B的表达在宫颈癌的疾病进展中可能发挥了一定作用。推测其可能的机制，我们认为LSIL组、HSIL组外周血IL-28B mRNA高于宫颈癌术前组、术后组，可能由于HPV等刺激导致宫颈上皮细胞、局部的巨噬细胞等产生的IL-28B增多；而随着疾病进一步进展恶化至宫颈癌时，被HPV“侵蚀的”上皮细胞等大量凋亡甚至脱落进而使IL-28B表达量降低。

综上所述，IL-28B基因的rs12979860、rs8099917多态性位点可能与宫颈癌发病无明显相关性，IL-28B可能主要通过表达量的不同进而影响宫颈疾病的进展甚至肿瘤转移。但是，本研究样本量较小、实验条件有限，并未能收集宫颈组织标本进一步验证宫颈组织中IL-28B mRNA的表达。本研究所发现的IL-28B在宫颈疾病各个阶段中的差异表达现象，尚需进一步实验探究其可能的机制。