ELISA测定猪尿液中β-受体激动剂残留的准确性评价

张泽宇 ，苏 扣 ，王 瑞 ，霍乃蕊 ，赵思俊

（1. 山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3. 天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384；4. 安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036）

β-受体激动剂常被非法添加到饲料中，用以促进动物生长和提高瘦肉率。人摄入过多含有β-受体激动剂残留的动物性食品，可引起肌肉震颤、腹痛、恶心、心动过速、心率加快等中毒症状，严重者危及生命[1]。我国早在2002年就明确，在食品动物生产中，禁用克伦特罗（Clenbuterol，CLE）、沙丁胺醇、莱克多巴胺等β-受体激动剂类药物[2]，并规定在所有可食用动物组织中均不得检出[3-5]。近年来，随着对上述药物监管力度的加强，溴氯特罗、马布特罗、溴布特罗、苯乙醇胺A等克伦特罗的同系物在动物养殖、运输和屠宰环节都有不同程度的检出[7]。

为了更好地监管β-受体激动剂在食品动物生产中的违法使用，国内外科研人员对检测方法进行了深入研究。常用的β-受体激动剂检测方法主要有仪器测定法、免疫快速测定法等[8]。前者如气相色谱-质谱联用法、液相色谱串联质谱法、液相色谱-飞行时间质谱法等[9-11]检测结果可靠，但设备昂贵，检测过程繁琐[12]。而ELISA等免疫测定法由于特异性强、操作简单、快速，且检测成本低，被广泛应用于大批量样品的筛查和基层监管工作中[13-14]。

本文作者在开展ELISA检测过程中，对不同保存时间的猪尿液进行ELISA测定时发现，对冷冻保存半年的猪尿液进行添加回收测试时的药物回收率高达330.00%～5 173.25%，检测限达58.8 ng/mL；而以新鲜尿液进行添加回收试验的样品回收率在65.00%～118.00%之间，检测限为0.8 ng/mL，检测参数均在兽药残留检测方法允许的范围内。

为此，本研究以新鲜猪尿液、冷冻保存半年以上的猪尿液样品为研究对象，采取不同的样品前处理方法，对应用间接竞争ELISA方法测定猪尿液中克伦特罗等β-受体激动剂药物进行了较为详细的比较研究，以提高检测的灵敏度、准确性，并考察所用单抗与克伦特罗结构类似药物的交叉反应性，为准确度高、适用性强的克伦特罗快检试剂盒研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

自山东省某养猪场采集的新鲜猪尿5份和本实验室冷冻储存半年以上的猪尿5份（均经液相色谱-串联质谱确证检测为克伦特罗等β-受体激动剂阴性），分成若干份储存在-20 ℃冰箱内。克伦特罗、溴氯特罗、马布特罗、溴布特罗、沙丁胺醇、异克伦潘特、克伦塞罗、班布特罗、特布他林、喷布特罗、吡布特罗等标准品：购于Dr. Ehrensorfer公司；牛血清白蛋白（BSA，99.9%）、兔抗鼠IgG-HRP、四甲基联苯胺（TMB）：购于美国Sigma-Aldrich公司。

克伦特罗包被抗原（CLE-OVA）：中国农业大学国家兽药安全评价中心馈赠；克伦特罗单克隆抗体（1F8B10B7）：购于英国Abcam公司。包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（CBS，pH9.6，0.05 mol/L），磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4，0.01 mol/L）；洗涤液：含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST，pH7.4，0.01 mol/L）；封闭液：含1% BSA的PBST；显色液：TMB的醋酸-柠檬酸缓冲液；终止液：2 mol/L硫酸溶液。

1.2 仪器与设备

MCX SPE小柱：购于上海安谱实验科技有限公司；高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品，型号5804R；氮吹仪：美国Organomation公司产品；In fi niteF50酶标仪：瑞士TECAN公司产品；酶标板：型号为42592，购于美国Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 酶标二抗最佳工作浓度测定 将酶标二抗按 1∶1 000～1∶400 000 进行 7 个浓度稀释，每个浓度3孔平行，加入96孔酶标板中，80 μL/孔，孵育1 h后加1% BSA封闭2 h，然后加TMB底物显色液100 μL/孔，室温避光孵育15 min，每孔加终止液（50 μL/孔）终止反应，在波长450 nm处测OD值。

1.3.2 间接竞争ELISA操作 将包被抗原（CLEOVA）加入96孔酶标板中，80 μL/孔，孵育1 h后加1% BSA封闭2 h，每孔加50 μL样品/标准溶液和CLE单抗，孵育1 h后，加稀释后的兔抗鼠 IgG-HRP，50 μL/孔，孵育 1 h，然后加 TMB底物显色液100 μL/孔，室温避光孵育15 min，每孔加终止液（50 μL/孔）终止反应，在波长450 nm处测OD值。上述操作中，包被、封闭和抗原抗体反应均在37 ℃避光孵育，每次反应后均用PBST溶液洗涤4次。

1.3.3 绘制标准曲线和IC50计算 将CLE标准品分别稀释成 0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3 ng/mL，将单克隆抗体稀释至1.3.1确定的最佳工作浓度，封闭后每反应孔内加入CLE标品溶液和CLE单抗各40 μL。以OD值为纵坐标，每孔中标准品的终浓度对数为横坐标，绘制标准曲线，使用软件Ridasoft.win计算IC50。

1.3.4 SPE净化处理 取猪尿样品2 mL，加入1 mL 0.1%甲酸水溶液后，加入经3 mL甲醇和3 mL水活化的MCX小柱，分别用3 mL水、3 mL甲醇淋洗小柱，再用抽滤器抽干小柱；最后用3 mL 5%氨化甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，50 ℃氮气吹干后，加入2 mL磷酸盐溶液复溶，备用。

1.3.5 加标回收试验 分别取适量的新鲜猪尿和冷冻储存半年的猪尿液（n=5），直接上样或经MCX小柱净化处理后上样，利用间接竞争ELISA法进行添加回收试验。

1.3.6 检测限测定 依据Liu等[21]和Barreiro等[22]的方法，各取新鲜猪尿和冷冻储存半年以上的猪尿40份，其中20份经MCX小柱净化处理后使用，另外20份尿液直接利用间接竞争ELISA，根据标准曲线将各样品OD值转化为浓度（ng/mL）。

1.3.7 交叉反应率 将与克伦特罗结构相似的溴布特罗等药物作系列稀释[26-28]，按1.3.2进行操作，绘制各药品的浓度-抑制标准曲线，计算各结构相似药物的IC50值，计算交叉反应率。

2 结果与分析

2.1 ELISA反应条件优化

CLE-OVA抗原及CLE单抗的最适作用浓度：不同浓度抗原和抗体的阵列间接ELISA反应结果如表1所示。 由表1可见，OD值≥1且最接近于1，P/N值≥2.1，故确定这两个稀释度为最佳工作浓度并用于后续间接竞争ELISA分析。选择OD值接近1是为了便于绘制标准曲线和IC50计算。

经间接ELISA反应条件优化，确定包被抗原浓度为1∶40 000，抗体浓度为1∶20 000，封闭液为1%，封闭时间1 h最佳，抗体最佳作用时间为60 min，酶标二抗最佳稀释倍数为1∶50 000，酶标二抗最佳作用时间为60 min，底物显色时间为15 min。

表1 不同浓度CLE-OVA抗原及CLE单抗的间接ELISA OD450测定结果

2.2 CLE的IC-ELISA标准曲线

以7个浓度的CLE标准溶液进行IC-ELISA反应，经Logistics函数的四参数方程拟合，所得标准曲线（图1）的线性范围为0.016～8.520 ng/mL，IC50值为0.57 ng/mL。

图1 克伦特罗IC-ELISA标准曲线

2.3 检测限

从图2可以看出，冷冻储存超过半年的5份猪尿（共20份）经过MCX小柱SPE处理后，经IC-ELISA测试，反应孔显色较未经SPE净化处理组的颜色更深一些，OD450nm值显著高于未经SPE净化组。根据标准曲线计算得出每个反应孔相对应的CLE浓度（图3），未净化处理的20份阴性猪尿，CLE浓度平均值为（47.37±3.83）ng/mL，LOD 为 58.85 ng/mL。经MCX净化后的20份阴性猪尿CLE浓度平均值为（0.03±0.02）ng/mL，LOD为0.08 ng/mL； 净化和未净化的检测限相差730余倍，极易造成ELISA检测中出现误判的情况。

2.4 加标回收率

图2 经SPE净化和未净化的40份空白猪尿OD值

图3 经SPE净化和未净化的40份空白猪尿测定结果

试验结果显示，冷冻保存的猪尿液不经MCX小柱净化处理直接进行ELISA检测，在添加浓度为0.9、2.7、8.1 ng/mL时，回收率为85.19%～5173.25%，变异系数为4.78%～96.79%；且添加浓度越低，回收率越高，实测浓度远远高于添加浓度，所以易于造成假阳性结果；而经MCX柱处理后，相同的添加浓度，药物回收率在101.21%～119.10%之间，变异系数为6.05%～18.38%，符合兽药残留酶联免疫分析的要求，能够满足ELISA在开展日常快速检测的需要。

2.5 新鲜猪尿液测定

此外，本试验还对采集的新鲜猪尿液进行了测试，发现新鲜猪尿液样品不经MCX柱净化直接进行ELISA测定的检测限为0.09 ng/mL，与冷冻保存半年以上猪尿液经MCX柱净化后的结果无明显差别。在添加浓度为0.9、2.7、8.1 ng/mL时，回收率为60.47%～124.47%，变异系数为8.15%～19.46%。

2.6 交叉反应率

如表2显示，溴氯特罗、马布特罗、溴布特罗等3种药物与克伦特罗交叉反应明显，交叉反应率分别为80.0%、57.1%和38.1%，而沙丁胺醇、异克伦潘特、克伦塞罗、班布特罗、特布他林、喷布特罗、吡布特罗等7种药物的交叉反应率均低于1.0%。

3 讨论

3.1 ELISA反应条件优化

表2 克伦特罗与10种结构类似药物的交叉反应率

ELISA反应条件，如包被抗原的浓度、抗体稀释倍数、反应时间等都会影响ELISA的检测结果。抗原的包被浓度和抗体的工作浓度是影响ELISA反应的重要因素之一，浓度过高和过低都不合适。本试验采用方阵法对反应条件进行了优化，最终确定包被温度37 ℃，包被时间为1 h，竞争时间为0.5 h，包被抗原稀释倍数为1∶40 000，抗体稀释倍数为1∶20 000，封闭液为1% BSA。以此条件建立克伦特罗间接竞争ELISA检测方法的标准曲线，IC50为0.57 ng/mL。

3.2 ELISA特异性

ELISA检测方法的特异性主要取决于抗体是否对特定分析物表现出高度的特异性。本研究结果表明，所选用的克伦特罗抗体对克伦特罗及其同系物溴氯特罗、马布特罗和溴布特罗有交叉反应性，从分子结构式（表2）可以看出，这4种药物的化学结构极为相似，仅在苯环上的取代卤素基团不同。4种药物在苯环左侧均含有间位-NH2基团，-NH2基团邻位均含有-Cl、-Br等卤素基团，且烃基链均含有叔丁基；而本试验中测试的其余7种交叉反应不明显的药物只满足上述一种条件。一种情况为左侧有卤素基团，但右侧无叔丁基，另一种情况与之相反。进一步表明，本试验所用抗体的特异性较强，抗原抗体的识别位点包括分子结构式中左侧苯环上的基团和右侧叔丁基基团；利用该抗体建立的ELISA方法，可针对克伦特罗、溴氯特罗、马布特罗和溴布特罗等结构同系物。

3.3 不同处理方法对ELISA检测猪尿样品的影响

本研究以新鲜猪尿液和冷冻保存半年以上的猪尿液为研究对象，分别采用直接ELISA测定和经MCX小柱净化处理后进行测定，结果发现新鲜猪尿液净化与否，对ELISA测定的准确度、精密度和检测限无明显影响；而对于冷冻时间较长的尿液，解冻后呈深黄色混浊液体，可能由于尿液中色素和蛋白等基质在长期保存过程中发生一些变化，从而导致ELISA测定时基质效应增强，药物的准确度、精密度、检测限（回收率为85.19%～5173.25%，变异系数为4.78%～96.79%，而LOD达58.85 ng/mL）均有较大变化，直接影响ELISA检测的准确度；而经MCX小柱净化处理后，猪尿液样品中的杂质被有效去除，添加回收试验结果也显示，药物回收率为101.21%～119.10%，变异系数为6.05%～18.38%，LOD为0.076 ng/mL。由此可见，为了避免ELISA检测假阳性的出现，提高IC-ELISA的灵敏度，对猪尿样品进行适当的样品前处理是必需的。在ELISA检测时，如果尿液浑浊，通常要对猪尿样品采用过滤或离心的方式进行处理，但尿液成分复杂，而且经过较长时间储存后，尿液中色素、金属离子等杂质可能会发生一些变化，从而在ELISA测试中干扰抗原、抗体之间的反应，直接影响试验结果的可靠性[29-30]。

本试验采用MCX混合阳离子型固相萃取小柱，通过洗涤、洗脱等步骤，可有效去除猪尿中的色素、蛋白质、盐等杂质，从而减少对抗体的生物活性影响，使抗体与包被抗原或待测物的结合更为紧密，从而大大提高了ELISA检测的准确度和灵敏度，使各项检测参数（回收率、变异系数、检测限等）均符合免疫残留检测标准[31-32]，为今后开展ELISA快速筛查过程中避免出现假阳性而造成的误判提供了可靠的技术支撑。