志贺氏菌可视浊度/荧光环介导等温扩增方法的建立

贺生芳，郭澍强，谈静惠，马晓花，杨旭光，郝俊虎

（银川海关综合技术中心，宁夏银川 750001）

志贺氏菌（Shigella）俗称痢疾杆菌，可引发急性痢疾[1]。近年来，因为食入被志贺细菌污染的食品而导致的食品安全问题逐渐引起大家关注。因此，建立志贺氏菌快速、准确、灵敏、特异的检测方法，及时发现潜在的食品质量问题，阻止不合格食品流入市场，成为保证食品安全有效的关键因素。

目前，我国志贺氏菌属检测方法主要采用国标法。其中：细菌分离培养法，操作繁琐，检测周期长、灵敏度低；分子生物学检测方法（包括普通PCR和荧光定量PCR方法等）均存在检测灵敏度低以及气溶胶污染等问题[2-4]。环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermal amplification，LAMP）是日本荣研化学株式会社学者建立的一种新型核酸扩增方法，通过针对靶基因的 6个区域设计 4条或者6条特异引物，利用链置换DNA 聚合酶，在恒温条件下作用 40～60 min，即可完成核酸扩增反应[5-6]。本试验通过将LAMP技术分别与荧光检测技术和浊度检测技术相结合，使整个恒温扩增过程能够实现实时监测，并且将结果以浊度、荧光曲线直观反应[7-9]，从而为实验室和现场检测提供一种快速且易于操作的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 试验中所用菌株见表1。

1.1.2 试剂 细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（产品批号B518225）：上海生工；2×反应缓冲液RM；Bst DNA聚合酶（产品批号5Z006）：荣研生物科技（中国）有限公司；2×Taq PCR Master Mix（产品批号 P4218）、DL 1000 DNA Maker（产品编号3591A）：天根生化科技（北京）有限公司；Isothernal MasterMix购自英国OptiGene公司；各细菌培养基购自北京路桥。

表 1 试验中所用到的菌株

1.1.3 仪器设备 Applied Biosystems Veriti 96-Well PCR扩增仪：美国ABI；LT-16alpha 恒温扩增基因检测系统：日本荣研；OptiGene便携式基因荧光扩增仪：英国OptiGene公司；Bio-rad ChemiDocXRS+凝胶成像系统：美国Bio-Rad 伯乐；DYY-12型电泳仪、Heal Force生物安全柜：北京市六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物设计 根据GenBank上的志贺氏菌的保守基因序列，分析比较后选取编码侵袭性质粒相关抗原H的片段基因（ipaH）保守区域，使用在线软件Primer Explore Version设计一套反向内因物（BIP）、正向外引物（F3）反向外引物（B3）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 菌株核酸提取 所有菌株核酸提取按照上海生工细菌基因组DNA快速抽提试剂盒（产品批号B518225）说明书进行。

1.2.3 LAMP-浊度扩增体系、LAMP-荧光扩增体系、PCR扩增体系 LAMP-浊度扩增体系为25 μL：2×ReactionMIX 12.5 μL（ 包 括 Tris-HCL 40 mmol/L，KCl 10 mmol/L，MgSO416 mmol/L，(NH4)2SO420 mmol/L，Tween20 0.2%，Betaine 1.6 mmol/L，dNTPs 2.8 mmol/L），Bst DNA聚合酶 DNA 1 μL，5 pmol F3 和 B3 引物各 1 μL，40 pmol FIP和 BIP引物各 1 μL，DNA 模板 2 μL，用灭菌双蒸水补足体系至 25 μL；设置5个反应温度（60～64 ℃），反应1 h。LAMP-荧光扩增体系使用Isother Master Mix反应试剂盒，25 μL反应体系：1×Isother Master Mix 15 μL，5 pmol F3和 B3引物各 1 μL，40 pmol FIP 和 BIP 引物各 1 μL，DNA 模板3.5 μL，用灭菌双蒸水补足体系至 25 μL；设置6个反应温度（60～65 ℃），反应1 h；最后使反应温度升高至98 ℃，然后以0.05 ℃/s的速度降温至85 ℃作熔解曲线，反应约6 min终止反应。PCR扩增体系 20 μL：2×Taq PCR Master Mix 10 μL、F3引物 1 μL、B3 引物 1 μL、模板 1 μL，用灭菌双蒸水补足体系至 20 μL，退火温度为58 ℃。

1.2.4 LAMP-浊度、LAMP-荧光方法特异性分析抽提表1中菌株核酸作为模板，分别用建立的两种LAMP方法扩增和检测，检验方法的特异性。利用LAMP引物中的外引物做PCR扩增，检验针对特定菌株的PCR方法特异性，同时和LAMP方法特异性结果进行比较。

1.2.5 LAMP-浊度、LAMP-荧光方法灵敏度分析 将过夜培养好的、处于对数生长期的新鲜菌液，用无菌生理盐水进行10-1～10-5系列稀释。采用稀释平板法，对其纯培养物进行计数，求得原菌液浓度，同时从每稀释度菌液中取 1 mL直接用试剂盒法提取DNA，并依此作为模板，分别用建立的两种LAMP方法扩增和检测，确定各方法灵敏度，同时将同样浓度的菌株 DNA 模版加入 PCR 反应体系，进行 PCR 扩增，对比3种方法的灵敏度。

2 结果

2.1 LAMP引物序列

编码侵袭性质粒相关抗原H的片段基因（ipaH）决定志贺氏菌对大肠粘膜的上皮细胞侵袭能力，同时多拷贝存在于染色体和侵袭大质粒上，不随传代而丢失，以志贺氏菌ipaH基因保守序列为靶基因，可将其与其他致病菌区分开，又可以全部检测出志贺氏菌4个群。志贺氏菌特异性基因的LAMP引物序列见表2。

表 2 志贺氏菌特异性ipaH基因的LAMP引物序列

2.2 LAMP-浊度、LAMP-荧光反应温度优化

利用日本荣研LT-16alpha 恒温（浊度）扩增基因检测系统进行检测发现，反应在60、61、62、63、64 ℃ 5个温度，分别扩增30 min时均有扩增，出峰时间略有不同（图1），在63 ℃时出峰时间最早，Tm值为16∶08，因此LAMP-浊度扩增方法最佳反应温度确定为63 ℃。

图 1 LAMP-浊度扩增63 ℃出峰图

利用OptiGene便携式基因荧光扩增仪进行恒温扩增显示，反应在60、61、62、63、64、65 ℃6个温度，分别扩增30 min时均有扩增（图2），在64 ℃时出峰时间最早，Peak Value值为21∶01，因此LAMP-荧光扩增方法最佳反应温度确定为64 ℃。

图 2 LAMP-荧光扩增64 ℃出峰图

2.3 LAMP-浊度、LAMP-荧光方法特异性分析

采用4株目标菌株和10株非目标菌株进行LAMP-浊度检测，发现目标菌均产生大量焦磷酸镁白色沉淀，反应液浊度上升，浊度曲线明显上升，而非目标菌则均未发生反应（图3），表明建立的LAMP-浊度方法具有良好的特异性。

采用3株目标菌株和4株非目标菌株进行LAMP-荧光检测，发现目标菌有特异性扩增，而非目标菌都没有扩增（图4），表明建立的LAMP-荧光方法具有良好的特异性。

2.4 LAMP-浊度、LAMP-荧光方法灵敏度分析

图 3 LAMP-浊度特异性试验扩增曲线

图 4 LAMP-荧光特异性试验扩增曲线

将过夜培养好的处于对数生长期的1 mL志贺氏菌液用新鲜无菌的生理盐水进行 10 倍系列稀释，取0.1 mL进行涂布，采用稀释平板法对其纯培养物进行计数。福氏志贺氏菌液原浓度为（129+130+151）/3×104×10=13.6×106cfu/mL。

如表3所示，LAMP-浊度方法菌液最低检出浓度为13.6 cfu/mL；如表4所示LAMP-荧光方法菌液最低检出浓度为1.36 cfu/mL；如图5所示，PCR最低菌液检出浓度为136 cfu/mL。3种方法比较，建立的LAMP-荧光方法的灵敏度最好，是普通PCR的100倍。

表 3 LAMP-浊度灵敏度试验

表 4 LAMP-荧光灵敏度试验Peak Value值

图 5 PCR扩增灵敏度电泳分析图

3 讨论

LAMP作为一种新的核酸扩增技术，因具有反应成本低、仪器简单、操作简便、灵敏度高、特异性强等特点成为核酸检测的研究热点。在LAMP反应中，引物的选择往往能够决定扩增反应的特异性和灵敏度[9-11]。本研究通过试验选择出一套特异性和灵敏度都很高的引物，建立的LAMP-浊度方法菌液最低检出浓度为13.6 cfu/mL，LAMP-荧光方法菌液最低检出浓度为1.36 cfu/mL，而普通PCR最低检测浓度是136 cfu/mL，这与国内其他实验室所建立的志贺氏菌LAMP方法中菌液最低检 出 浓 度 28 cfu/mL[5]、20 cfu/mL[7]、40 cfu/mL[8]相比较存在明显优势。这就意味着对细菌含量较少的样品进行检测时，本试验建立的LAMP方法能够提高检出率，同时本方法扩增30 min内就可以显示检测结果，加上样本核酸的提取等过程，整个检测过程在1.5 h内可以得出反应结果。

目前比较常见的LAMP方法多数采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果[5-6]， 但要打开反应管，导致存在气溶胶污染实验室的危险；或者通过肉眼观察反应管中颜色的变化判断浊度[6，12-13]，但会因视觉差异导致出现结果差异。由于不能实时监控，所以当试验出现问题时，不能有效分析试验过程。而恒温扩增技术与浊度检测技术结合，通过计算可以得出相当于荧光PCR“CT值”的出峰时间，灵敏度更高，因而避免了肉眼观察带来的人为误差，结果判定更为客观；或与荧光检测技术结合，反应体系中预先加入了荧光染料，使用 488 nm 激发光源、520 nm发射热循环荧光监测，实时收集记录 LAMP反应扩增的荧光信号，自动生成扩增曲线，实时监控扩增反应[14-15]。两种方法不需要开盖加染料或者电泳，防止了气溶胶的形成，避免了因污染环境而造成的假阳性。