超高效液相色谱法测定不同配伍比黄芪—葛根药对中葛根素的含量

林静瑜， 李东晓， 戴雅彬， 黄可儿

（1.福建省中医药研究院，福建福州 350003；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；3.福建卫生职业技术学院，福建福州 350101）

黄芪—葛根药对出自于《证治汇补》卷三之黄芪葛根汤，方中著有“黄芪一两、葛根五钱”，用于“酒郁”，《医略六书》将此方作为“虚人伤酒恶寒之专方”，清代张锡纯玉液汤以“黄芪五钱、葛根一钱半”组方治消渴，现临床多用于治疗气阴两虚的糖尿病及其并发症和痹症等[1-3]。中药是复杂化学成分的载体，药对是研究中药复方的最基本单位，不同配伍规律的药对共煎煮后，其化学成分及成分的比例可能会产生较大的变化，从而导致药理活性的改变[4-6]。课题组前期研究发现，黄芪—葛根药对改善胃黏膜损伤效果不错，且在配伍比例不变时，其胃黏膜保护作用与不同水煎工艺所得的葛根素含量有一定的相关性[7，8]。葛根素为中药野葛的质控成分，药理研究证实葛根素具有一定的胃黏膜保护作用[9，10]。为进一步探讨黄芪、葛根药对配伍规律对其胃黏膜保护药效物质的影响，本研究以葛根素含量为评价指标，采用超高效液相色谱—紫外（UPLC-UV）法研究不同配伍比例的黄芪、葛根水煎后葛根素含量的影响，现将研究结果报道如下。

1 材料

1.1仪器ACQUITY H-Class超高效液相色谱仪（包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、EmpowerⅢ色谱工作站，Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱（美国Waters公司）；SB-5200DT超声清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；AEG-220电子分析天平（日本岛津公司）；Direct-Q3型高纯水制备仪（美国Milipore公司）；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.2药品与试剂黄芪（产地甘肃，南京同仁堂中药饮片有限公司，批号：20180908），葛根（南京同仁堂中药饮片有限责任公司，批号：20170701），黄芪、葛根饮片由福建中医药大学中药鉴定教研室车苏容副教授鉴定，分别为豆科植物 蒙 古 黄 芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao的根、豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwir的根；葛根素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110752-201514，纯度95.5%）；甲醇（德国Merck公司，色谱纯）；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1对照品溶液和供试品溶液的制备

2.1.1 葛根素对照品溶液的制备 取葛根素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成浓度1.021 mg·mL-1的葛根素对照品液，4℃贮存，备用。

2.1.2 黄芪—葛根药对供试品溶液的制备 参照文献[6]水煎工艺，取黄芪、葛根药材各适量，制备8个不同配伍比黄芪—葛根药对水煎液（0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1、1∶2、1∶3、1∶5），总药材量固定为100 g，水煎浓缩为1 g·mL-1。取水煎液1 mL，加4 mL蒸馏水稀释，混合均匀。精密吸取水煎稀释液5 mL置于锥形瓶中，加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷；加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密吸取续滤液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得各配伍比供试品溶液。

2.1.3 阴性供试品溶液的制备 取黄芪药材适量，按“2.1.2”供试品溶液制备方法制备不含葛根的黄芪水煎液，作为阴性供试品溶液。

表1 不同配伍比黄芪—葛根药对组成Table 1 Different compatibility ratios of Radix Astragali-Radix Puerariae herb pair

2.2方法学考察

2.2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇—0.1%冰醋酸水溶液（29∶71）；流速：0.2 mL·min-1；检测波长：250 nm；柱温：30℃；进样量：2 μL，理论塔板数按所测葛根素色谱峰计算不低于6 000。

2.2.2 专属性试验 精密吸取“2.1.1”制备的葛根素对照品溶液、阴性供试品溶液及黄芪—葛根药对水煎液（2∶1，批号：20181022）供试品溶液各2 μL，注入色谱仪，按“2.2.1”色谱条件分析，记录葛根素对照品、供试品的色谱图及保留时间。结果显示：葛根素的保留时间约为8.6 min，此色谱条件下黄芪—葛根药对水煎液中葛根素峰形良好，出峰时间稳定，具有良好的专属性，葛根素对照品溶液和供试品溶液在同一保留时间处出峰，阴性供试品溶液没有色谱峰出现，见图1。

2.2.3 线性关系考察 精密吸取葛根素对照品液，加甲醇分别配制成0.816 8 mg·mL-1、0.510 5 mg·mL-1、0.255 3 mg·mL-1、0.127 6 mg·mL-1、0.063 8 mg·mL-1、0.031 9 mg·mL-1的标准溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件进行分析，记录保留时间和峰面积。以对照品溶液浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得线性回归方程Y＝5.989 5×107X-1.832 7×106（r＝0.999 7），结果表明葛根素在浓度0.031 9～0.816 8 mg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 精密吸取葛根素对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录色谱图，并计算其峰面积相对标准偏差（RSD，sR）为0.85%，结果表明仪器精密度符合要求。

2.2.5 重复性考察 精密吸取黄芪—葛根药对水煎液（2∶1，批号：20181022）1 mL，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法平行操作6次，按“2.2.1”色谱条件进行测定并记录色谱图，计算葛根素含量，结果其sR为2.62%，表明该方法重复性符合要求。

2.2.6 稳定性试验 精密吸取同一黄芪—葛根药对水煎液，按“2.1.2”供试品溶液制备方法制得供试品溶液，于制备后0、2、6、8、10、12、24 h分别取同一供试品溶液2 μL进样，在“2.2.1”同一色谱条件测定葛根素峰面积，计算葛根素峰面积sR为0.25%，表明样品在24 h内稳定。

2.2.7 加样回收率 吸取上述已知葛根素含量的黄芪—葛根药对水煎稀释液（2∶1，批号：20181022）适量（含葛根素1.401 3 mg）， 共6份，置于锥形瓶中。按1∶1比例加入葛根素对照品溶液，摇匀，按“2.1.2”项下方法制得供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件方法进样2 μL。计算加样回收率，结果平均回收率为96.11%，sR为1.28%，见表2。

图1 葛根素对照品及黄芪—葛根药对水煎液色谱图Figure 1 UPLC.Results of puerarin reference and the decoction of Radix Astragali-Radix Puerariae herb pair

2.2.8 含量测定 按“2.1.2”项下方法，平行制备5份8个不同配伍比黄芪—葛根药对（0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、5∶1、1∶2、1∶3、1∶5）供试品溶液。按“2.2.1”项下葛根素的色谱条件方法进样2 μL，测定葛根素峰面积，代入“2.2.3”线性方程中，计算各药对水煎液中葛根素的平均质量浓度及平均含量。葛根素质量浓度及含量数据以均数±标准差()表示，采用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析。各组资料若符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性，采用Dunnett-t检验，方差不齐时，采用Dunnett'sT3检验。结果显示：与黄芪—葛根药对0∶1配伍比组（葛根单煎液）相比，加入黄芪的各配伍比组葛根素含量均有增加的趋势，并随黄芪在药对中比例的增高而上升，但非倍增关系。其中，药对以5∶1配伍时，葛根素含量最高，配伍比为3∶1、2∶1、1∶1时次之（与0∶1配伍比组比较，均P＜0.01）。见表3。

表2 葛根素加样回收率试验Table 2 The recovery.Results of puerarin

表3 不同配伍比黄芪—葛根药对水煎液中葛根素的含量测定Table 3 Comparison of the puerarin content of Radix Astragali-Radix Puerariae herb pair with different compatibility ratios（n=5）(-x ± s)

3 讨论

3.1色谱条件的选择《中国人民共和国药典》（2015）规定野葛药材中葛根素含量不低于质量分数2.4%。本研究采用超高效液相色谱—紫外法检测葛根素，通过分析供试品特征图谱，发现黄芪—葛根药对水煎液的相关成分紫外吸收主要集中在220～350 nm处，且葛根素在250 nm处有最大吸收。同时考察了甲醇—水，甲醇—0.1%醋酸水溶液、乙腈—水和乙腈—0.1%醋酸水溶液等流动相系统，结果显示：以甲醇—水为流动相时，葛根素色谱峰拖尾严重，而以乙腈代替甲醇，葛根素色谱峰峰型较好，但与其他成分色谱峰分离度差。若以0.1%的醋酸代替水，葛根素峰型较好且分离度好，最终确定“2.2.1项”下色谱条件。

3.2黄芪—葛根药对的不同比例配伍对葛根素浓度、煎出量的影响剂量与配伍比是中药组方的一个重要环节，其合理性也逐渐得到现代科学的验证。黄芪—葛根药对常见配伍比主要有1∶1、2∶1、3∶1或其近似值，葛根比例高于黄芪则较少见。研究报道：黄芪和葛根配伍时，大多数成分的溶出量较单煎时高[11]。本研究侧重考察黄芪—葛根药对配伍比例对葛根素煎出量的影响，研究结果（表3）显示：①黄芪—葛根药对中葛根素的浓度随着葛根比例的增高而上升，但无倍增关系，以0∶1配伍比组（葛根单煎液，葛根比例为100%）最高，5∶1配伍比组（葛根比例为16.7%）最低；②黄芪—葛根药对中黄芪对葛根素的煎出量有明显的促进作用，葛根素的煎出量随着黄芪在药对中比例的增高而呈波段式上升，以5∶1配伍时（黄芪比例为83.3%）葛根素煎出量最高，3∶1、2∶1次之，1∶1居中，1∶2、1∶3、1∶5 3个配伍比组中葛根素的煎出量较低，但仍呈高于葛根单煎液的趋势，说明黄芪对葛根素的煎出量影响明显；③黄芪—葛根药对水煎液中葛根素浓度同时受药对中葛根的比例及黄芪的配伍的影响。该部分结果与佟志斌等[12]的研究结果稍有不同，可能与本研究所采用的葛根来源、水煎工艺及处理方法等不同有关。

黄芪葛根汤中黄芪为“君”，葛根为“臣”，属“七情”中“相须”、“相使”配伍，不同的配伍比例对黄芪—葛根药对葛根素的含量存在明显的影响，说明临床黄芪—葛根药对的配伍应用确有其合理性。本研究仅就不同配伍比黄芪—葛根药对中葛根素的含量变化进行探讨。黄芪、葛根及其指标成分的配伍在药理和化学层次上是否存在相似的协同作用？我们将在后续工作中继续考察黄芪—葛根药对的配伍关系对其他指标成分的影响，并结合药效实验评价黄芪—葛根药对保护胃黏膜的作用基础。