加味扶正抑瘤汤及联合吉西他滨对胰腺癌的抑制作用

黎旭光， 刘开睿， 仇成江， 张生， 余丽， 黄有星

（1.广东省中医院腹部外科，广东广州 510006；2.广州中医药大学第二临床医学院，广东广州 510405；3.广东省中医院甲状腺血管外科，广东广州 510006）

胰腺癌（pancreatic cancer）是一种预后极差的恶性肿瘤，总体5年生存率低于5%[1]。目前，手术和化疗是治疗胰腺癌的主要手段。由于超过90%的患者在确诊时已丧失手术机会，以化疗为主的综合治疗的重要性日益突出[2]。吉西他滨（Gemcitabine，GEM）作为胰腺癌的一线化疗药物，其延长的中位生存期仅为5.4～5.6个月，疗效亟待改善[3]。中医药是肿瘤辅助治疗的重要手段，经多年的临床实践形成了扶正祛邪、益气养阴、活血祛瘀等治疗法则。加味扶正抑瘤汤由黄芪、龟板、全蝎和四君子汤等组成，具有滋阴补气、活血祛瘀之功。前期研究表明，此方对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[4-7]，然而关于其对胰腺癌细胞作用的研究尚未见报道。本研究拟探讨加味扶正抑瘤汤对胰腺癌细胞Panc-1体内和体外肿瘤生物学行为的影响，并进一步分析加味扶正抑瘤汤联合一线化疗药物吉西他滨对胰腺癌细胞的作用效果，从而明确加味扶正抑瘤汤在胰腺癌治疗中的作用，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞培养胰腺癌细胞株Panc-1购自中科院上海细胞库，采用含有体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养于37℃、体积分数5%CO2的培养箱。

1.2药物、试剂与仪器加味扶正抑瘤汤组方包括生黄芪30 g、西洋参15 g（另煎）、龟板15 g（先煎）、全蝎10 g、白花蛇舌草30 g、王不留行15 g、白术10 g、茯苓15 g、生甘草10 g、牡丹皮10 g、槲寄生15 g等，各味中药材均购自中国康美药业；吉西他滨（法国礼来公司，批号：H20161030）。胎牛血清（杭州四季青公司，批号：11011-8611）；DMEM（美国Gibco公司，批号：12100046）；Matrigel基质胶（美国BD公司，批号：YS000649）；MTT试剂盒（中国碧云天公司，批号：C0009）；Annexin V-FITC（美国Thermo公司，批号：BMS500FI-100）。Heracell CO2培养箱（美国Thermo公司）；CS-24超声水浴锅（中国朗博公司）；BenchMateC8微量离心机（美国 Oxfordlab公司）；RPR1204V药品冷藏箱、MK3酶标仪、Attune NxT流式细胞仪（美国Thermo公司）。

1.3药物制备方法

1.3.1 加味扶正抑瘤汤制备 ①用于大鼠：将上述剂量的中药置煎煮容器内，加相当于药材5倍量的冷水浸泡1 h，煮沸30 min，过滤；药渣再加3倍量的水，继续煎煮20 min，过滤；合并2次滤液，于水浴锅上浓缩成96 mL。②用于细胞：将中药包按质量1∶15进行水提，水浴锅60℃超声浸泡80 min，共3次。过滤、合并滤液，得到终质量浓度为1 g/mL的浓缩液175 mL用于体外实验，保存至4℃冰箱备用。使用时取出部分浓缩液，经12 000 r/min、15 min离心后，用0.45 μm滤膜过滤后调至pH7.0，在无菌条件下用0.22 μm滤膜过滤备用。

1.3.2 吉西他滨溶液配制 称取200 mg吉西他滨溶于20 μL DMSO溶液，加4.98 mL高糖DMEM完全培养基制成40 g/L的吉西他滨浓缩液，经无菌过滤后备用。

1.4体外细胞实验分组与给药实验设空白组、中药组、西药组、联合用药组等4组。空白组：仅加PBS；中药组（100 g/L加味扶正抑瘤汤）：1 mL 1 000 g/L加味扶正抑瘤汤浓缩液+9 mL完全培养基；西药组（20 μmol/mL吉西他滨）：取1 mL吉西他滨浓缩液+6.49 mL完全培养基配制成1 mol/L工作液，再取1 mL工作液+49 mL完全培养基配制；联合用药组（100 g/L加味扶正抑瘤汤浓缩液+20 μmol/mL吉西他滨）：5 mL 1 000 g/L加味扶正抑瘤汤浓缩液+1 mL吉西他滨工作液+44 mL完全培养基。

1.5 MTT法检测细胞增殖能力取Panc-1细胞，细胞长满瓶底80%时，消化细胞，按1×104个/孔接种于96孔板培养24 h，待细胞贴壁后，按不同处理组别分别加入相应含药培养基。作用24、48、72 h后，每孔分别加入5 g/L MTT溶液20 μL，应用酶标仪于570 nm波长处测定吸光度[D（λ）]。取各复孔D（570 nm）值的平均值作为统计数据。

1.6 Transwell法检测细胞迁移及侵袭取20μmol/L Matrigel基质胶，加入80 μmol/L 4℃预冷的无血清高糖DMEM培养基中，制备成100 μmol/L无血清Matrigel混合物。均匀加入Transwell小室，于37℃，体积分数为5%的 CO2的培养箱6 h待Matrigel基质胶凝固。取对数生长期的Panc-1细胞制备成细胞悬液，取1×105个细胞，稀释至200 μmol/L无血清DMEM培养基中。于24孔板内分别加入800 μmol/L不同处理组的含药培养基，分别放入含Matrigel基质胶和不含Matrigel基质胶的Transwell小室。将200 μL含1×105个细胞的无血清DMEM细胞悬液均匀加入小室内，随后将24孔板放入37℃，体积分数为5%的CO2的培养箱。无基质胶的小室孵育24 h（检测细胞迁移能力），含基质胶的小室孵育36 h（检测细胞侵袭能力）。取出小室，PBS冲洗，于40 g/L多聚甲醛溶液中固定细胞，1%结晶紫溶液染色，用棉棒将小室内层细胞擦去，自然风干后，于光学显微镜下拍照及细胞计数。

1.7 Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡取对数生长期细胞进行消化、离心、重悬；将细胞接种于6孔板内并置入恒温细胞培养箱继续培养24 h；使用不同处理组含药培养基处理细胞；放入37℃恒温培养箱培养72 h；使用无EDTA胰酶消化细胞，收集细胞悬液，1 500 r/min离心10 min去上清；使用2 mL PBS重悬细胞，再次1 500 r/min离心10 min去上清，重复本步骤1次后去除PBS；加入400 μL的Binding buffer重悬细胞，将细胞分为2管，每管200 mL，其中一管设为空白对照，另一管为处理组继续加入试剂进行处理；处理组加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，再加入5 μL碘化丙啶混匀后室温下避光孵育15 min；孵育完毕后于1 h内应用流式细胞仪检测。

1.8体内成瘤实验

1.8.1 动物 40只6周龄健康雄性C57/BL小鼠，体质量约0.02 kg，购于中山大学动物实验中心。

1.8.2 分组、造模与给药 将40只小鼠分为4组，即空白组、中药组、西药组、联合用药组，每组10只。每组小鼠均自由饮水、进食。适应性饲养3 d后，于小鼠左上肢内侧注射1×107个Panc-1胰腺癌细胞，建立胰腺癌小鼠动物模型。建模后，空白组自由饲养；中药组给予剂量为400 g/kg的加味扶正抑瘤汤灌胃，每日2次；西药组给予剂量为0.4 g/kg吉西他滨溶液灌胃，每日2次；联合用药组给予0.4g/kg吉西他滨+400 g/kg加味扶正抑瘤汤灌胃，每日2次。

1.8.3 指标观察 21 d后处死小鼠取瘤体，肉眼观察不同分组小鼠肿瘤生长情况。剥离瘤块，称取瘤质量，按下式计算肿瘤抑制率（p）。抑制率（%）=[（空白组平均瘤质量-实验组平均瘤质量）/空白组平均瘤质量]×100%。用40 g/L多聚甲醛将标本固定并拍照。

1.9统计方法采用SPSS 21.0（IBM）统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，数据分析前均进行正态性检验及方差齐性检验排除抽样误差，多组比较采用方差分析或Kruskal-Wallis检验，组间比较采用Bonferroni法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1加味扶正抑瘤汤对胰腺癌细胞Panc-1增殖功能的影响图1结果显示：中药组、西药组、联合用药组24 hD（570 nm）与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组48、72 hD（570 nm）比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步通过Bonferroni法进行组间差异比较发现，药物作用48 h后，联合用药组D（570 nm）明显低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05），而中药组、西药组D（570 nm）与空白组比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。提示联合用药相对于单独用药可以更有效抑制胰腺癌细胞增殖。药物作用72 h后，与空白组比较，西药组、联合用药组D（570 nm）明显降低（P＜0.05），且联合用药组D（570 nm）低于西药组，而中药组D（570 nm）差异无统计学意义（P＜0.05）。提示西药组对胰腺癌细胞的抑制作用不及联合用药组。上述结果综合提示，加味扶正抑瘤汤对胰腺癌Panc-1细胞增殖无显著抑制作用，但可以加强吉西他滨对胰腺癌Panc-1细胞增殖的抑制效果。

图1 各组不同时间段内胰腺癌Panc-1细胞增殖能力比较Figure 1 Comparison of the proliferation of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups in different time periods()

2.2加味扶正抑瘤汤对胰腺癌Panc-1细胞迁移与侵袭的影响迁移结果显示：空白组、中药组、西药组及联合用药组穿膜细胞个数分别为（166.67±18.358）、（158.56 ± 18.07）、（90.44±16.024）、（47.89±14.33），由方差分析得F=103.088，P＜0.01；进一步经Bonferroni检验，与空白组比较，除中药组，其他2组穿膜细胞个数均降低（P＜0.05），且联合用药组降低更明显。见图2。

侵袭结果显示：空白组、中药组、西药组及联合用药组穿膜细胞个数分别为（108.78±13.055）、（102.67±12.689）、（44.44±12.218）、（17.11±8.978），由方差分析得F=128.456，P＜0.01；进一步经Bonferroni检验，与空白组比较，除中药组，其他2组穿膜细胞个数均降低（P＜0.05），且联合用药组降低更明显。见图3。

图2 各组胰腺癌Panc-1细胞迁移能力比较Figure 2 Comparison of the migration of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups

图3 各组胰腺癌Panc-1细胞侵袭能力比较Figure 3 Comparison of the invasion of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups

上述2项结果提示，虽然100 g/L的加味扶正抑瘤汤对胰腺癌Panc-1细胞的迁移侵袭能力没有显著影响，但可以显著提高吉西他滨对胰腺癌Panc-1细胞迁移侵袭能力的抑制作用。

2.3加味扶正抑瘤汤对胰腺癌Panc-1细胞凋亡功能的影响图4结果显示，空白组、中药组、西药组及联合用药组晚期凋亡率分别为（2.951±0.996）%、（7.293±2.581）%、（29.366± 4.904）%、（55.100±4.882）%，由Kruskal-Wallis检验得F=32.522，P＜0.01。进一步经Bonferroni检验，与空白组比较，除中药组外，其他2组细胞凋亡率均明显增加（P＜0.05），且联合用药较单独化疗能更显著诱导细胞凋亡。提示加味扶正抑瘤汤可以协同吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡。

图4 各组胰腺癌Panc-1细胞凋亡情况比较Figure 4 Comparison of the apoptosis of pancreatic cancer Panc-1 cells in various groups

2.4加味扶正抑瘤汤对小鼠体内胰腺癌瘤体的影响小鼠成瘤实验检测胰腺癌细胞体内生长情况结果显示，中药组、西药组及联合用药组体内抑瘤率分别为（7.20±3.52）%、（38.90±5.91）%、（61.63±6.46）%，由方差分析得F=226.410，P＜0.01；进一步经Bonferroni检验，发现任何2组体内抑瘤率差异均具有统计学意义（P＜0.05），其中联合用药组的抑瘤率相对西药组平均高22.73%。提示加味扶正抑瘤汤可以协同吉西他滨抑制胰腺癌细胞Panc-1在体内生长。见图5。

3 讨论

胰腺癌是恶性度极高的消化系统肿瘤，其发病率及死亡率近年来仍有上升趋势。由于具有起病隐匿、进展迅速、早期转移等特点，胰腺癌手术可切除率不足10%，5年生存率低于5%，预后极差，严重影响国民健康[2]。吉西他滨作为治疗胰腺癌的一线化疗药物，能改善患者生存质量，但由于胰腺癌细胞对吉西他滨存在先天或后天的耐药性，导致其在改善生存期方面不甚理想，吉西他滨治疗后1年生存率仍不足20%[8]。近年来许多研究发现采用吉西他滨联合中药提取物或汤剂治疗，可以有效逆转胰腺癌对吉西他滨的耐药性并提高其治疗敏感性，这些研究结果揭示了胰腺癌中西医结合治疗模式的临床应用前景[9，10]。

胰腺癌属中医学“积聚”、“黄疸”、“腹痛”、“伏梁”等范畴。中医学认为其病机以脾胃虚损、正气亏虚为本，湿瘀毒内蕴为标，标本相互转化，治疗首当辨别标本虚实，施以清热利湿、疏肝理气、益气健脾等疗法[11]。加味扶正抑瘤汤为本院外科治疗肿瘤的经验方，通过扶正培本可改善机体内环境，提高自身抗肿瘤能力，通过抑瘤散结消癥可杀灭体内恶性肿瘤细胞。该方由生黄芪、西洋参、龟板、全蝎、白花蛇舌草、王不留行、白术、茯苓、生甘草、牡丹皮、槲寄生组成。以生黄芪、西洋参补气为君药；以龟板、槲寄生滋阴补肾，全蝎、白花蛇舌草攻散瘀毒为臣药；白术、茯苓、甘草，取四君子汤之意，益气健脾；以王不留行、牡丹皮活血祛瘀，生甘草缓急止痛，白花蛇舌草兼解毒利湿为佐药，生甘草调和诸药，兼为使药。诸药配伍，具有补气滋阴、健脾补肾，活血祛瘀解毒的功效，达到扶正抑瘤的目的。既往研究表明，加味扶正抑瘤汤可以通过抑制Bcl-2 mRNA及促进p53 mRNA表达起到抑制结肠癌HT-29细胞增殖功能[4]；在肝细胞癌中，随着药物浓度的增加，可以显著抑制肝癌细胞增殖迁移侵袭能力[6]；对晚期前列腺癌还能显著减少骨转移灶数目，延长生存期，提高生活质量[5，7]。上述研究表明，加味扶正抑瘤汤可通过多种途径发挥抗肿瘤作用。

图5 各组小鼠体内胰腺癌瘤体比较Figure 5 Comparison of the tumor growth in various groups

本研究首先验证加味扶正抑瘤汤对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及体内生长的影响。尽管文献报道加味扶正抑瘤汤可以显著抑制多种恶性肿瘤进展，但是本研究结果却发现治疗剂量的加味扶正抑瘤汤无论对胰腺癌细胞还是小鼠体内瘤体均无显著抑制效应。该结果一方面从分子机制角度提示不同组织脏器的恶性肿瘤在发生发展中存在差异，另一方面从传统医学的角度也说明胰腺癌的中药治疗不仅仅局限于扶正及抑瘤之法，还需要根据疾病的不同阶段辨证施治，符合中医学“同病异治”的原则。本研究进一步检验联合用药组与单药应用在抑制肿瘤发展上的区别，结果显示，联合用药组对胰腺癌Panc-1细胞体内外生物学行为的抑制效果显著强于吉西他滨单药的效果。虽然该研究未进一步揭示背后的分子机制，但是结合目前的研究报道，推测加味扶正抑瘤汤可能通过协同吉西他滨进一步放大下游信号传导途径对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的抑制效果。该现象潜在的具体机制仍有待进一步深入研究。

综上所述，加味扶正抑瘤汤对胰腺癌Panc-1细胞的增殖、迁移、侵袭及凋亡方面无显著抑制作用，但是在与吉西他滨联用后，可以显著提高吉西他滨对胰腺癌细胞的抑制作用，有望在胰腺癌的治疗中扮演增效剂的作用，起到辅助化疗的效果。