调胃承气汤对肠源性脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能的保护作用

张延林， 郑刚， 熊明， 王昊， 易绍龙， 努尔阿依木·莫合塔，依不拉音·库尔班， 黄虎， 赵锋利

（1.新疆喀什地区第一人民医院，新疆喀什 844000；2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

脓毒症是宿主对感染的反应失调而引起的致命性的多器官功能障碍[1]。多器官功能障碍综合征（MODS）表现为全身多种器官的正常功能受到严重影响，其中胃肠道一般为最早出现损伤且损伤程度最为严重的靶器官[2]。虽然胃肠道是人体最大的细菌和内毒素的贮存场所，在正常生理状态下它们对机体几乎无损害，但在病理情况下，细菌和内毒素通过受损的肠黏膜向其他器官迁移而发生肠源性脓毒症（GOS）[3]。

据临床调查显示，全世界范围内每年约有1百万例脓毒症患者，其死亡率高达25%，脓毒症已成为威胁人类生命健康的重要疾病[4]。目前除一般治疗措施、抗菌治疗、控制感染源等治疗方法外，还可运用中医药进行治疗[5]。有研究表明调胃承气汤可减轻重症胃肠功能障碍患者的病情危重程度[6]。调胃承气汤为《伤寒论》的缓下方，由大黄、炙甘草和芒硝3味药物组成，具有解热、解毒、调节胃肠道功能等药理作用[7，8]。本研究拟探讨调胃承气汤对肠源性脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能的保护作用机制，以期为临床用药提供实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物40只SPF级雄性SD大鼠，体质量280～320 g，由广东省医学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2013-0002；实验动物质量合格证号：44007200047550。动物实验环境：广东省中医药工程技术研究院SPF级动物实验室。设施使用许可证号：SYXK（粤）2010-0059。

1.2受试药物调胃承气汤（由大黄、芒硝、炙甘草3味中药组成），大黄（批号：130908261）、芒硝（批号：130707541）、炙甘草（批号：130713191）均购自康美药业股份有限公司。煎煮方法：以水2 L，煎煮大黄、炙甘草至1 L，去滓，纳芒硝，再用微火煮沸1～2次[9]。由实验动物与人体等效剂量关系计算得给药剂量：高剂量为9.45 g/kg，低剂量为4.73 g/kg[10]。

1.3实验试剂大鼠白细胞介素6（IL-6）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（批号：385r1229）、大鼠内 毒 素/脂 多 糖（LPS）ELISA试 剂 盒（批号：261180115）、肠型脂肪酸结合蛋白（iFABP）ELISA试剂盒（批号：387180115），均购自天津安诺瑞康生物技术有限公司。Occludin购自美国Proteintech公司，批号：66378-1-Ig。注射用乌司他丁（Ulinastatin）购自广东天普生化医药股份有限公司，产品批号：031609203。

1.4实验仪器Varioskan Flash型全波长多功能酶标仪（美国Thermo公司）；5450型小型高速离心机（德国Eppendorf公司）；Leica TP 1020型全自动脱水机、Leica RM2235轮式切片机（德国Leica公司）；YD62型石蜡包埋机、YD-AB型摊烘烤片机（浙江金华益迪公司）；DHG-9203型电热恒温干燥鼓风干燥箱（上海精密实验设备厂）；Shandon Gemini染色机（德国Thermo公司）；Olympus DP2-BSW型病理图像采集系统（日本Olympus公司）。

1.5动物模型复制采用盲肠结扎穿刺法（CLP）复制肠源性脓毒症大鼠模型[11]。实验前大鼠禁食不禁水12 h，使用100 g/L水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠。备皮后沿腹中线开口约2 cm，小心取出盲肠置于消毒纱布上，将粪便推至盲肠尾端。用1号医用真丝编织线于盲肠中段进行结扎，往盲肠尾端注射1 mL生理盐水稀释粪便，用10 mL注射器针头穿孔3次，使用棉签轻轻挤压盲肠使粪便能顺利流出，然后将盲肠小心放回腹腔。逐层缝合切口，腹腔注入5 mL 37℃生理盐水使大鼠生理复苏。归笼饲养，自由饮用水和饲料。造模成功标准：造模后大鼠出现竖毛、乏力少动、眼角分泌黏液、颤抖、体温异常等生理异常，炎症反应失调[12]。

1.6分组与给药将大鼠随机分为5组，即假手术组、模型组、乌司他丁组、中药高剂量组、中药低剂量组，每组8只。于造模后2、10、24 h按照10 mL/kg分别给予大鼠灌胃给药，并在最后1次给药后0.5 h结束实验。中药高、低剂量组大鼠分别给予调胃承气汤（剂量分别为9.45、4.73 g/kg）灌胃，假手术组与模型组给予等体积生理盐水灌胃。乌司他丁组按3 mL/kg给予大鼠腹腔注射乌司他丁（剂量为30 000 U/kg）。

1.7观察指标与方法

1.7.1 标本采集 实验结束时，用水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血，3 000 r/min离心10 min，取血清于-80℃冻存，取小肠组织10 cm固定于体积分数10%甲醛中，以备病理组织学与免疫组化法检测。

1.7.2 血清中各相关指标检测 严格按照ELISA试剂盒测试方法检测血清中IL-6、LPS和iFABP含量。将捕获抗体包被至微孔内壁表层，添加标准品，添加样品及生物素标记抗体，添加辣根过氧化氢酶标记的抗体，加底物显色终止实验。酶标仪检测吸光度（OD）值。

1.7.3 小肠黏膜病理学检查 将小肠组织固定于体积分数10%甲醛1～2 d后，切成厚度为2 mm的横截组织块，用水冲洗后在自动组织处理机中进行脱水、透明和浸蜡。运用组织包埋机进行包埋，冷却后切片4 μm，脱蜡。经二甲苯脱蜡后用染色机进行苏木素—伊红（HE）染色。封片，镜下观察。

1.7.4 occludin蛋白的免疫组化检查 同小肠黏膜病理学检查法制作切片，脱蜡，水化后用PBS冲洗3次，阻断；PBS冲洗3次，抗原修复，加入血清封闭，加入Ⅰ抗，PBS冲洗3次；加入Ⅱ抗，PBS冲洗3次，滴加SP，DAB显色5～10 min，自来水冲洗以终止反应，复染；常规脱水、透明、封片。显微镜下观察。

1.8统计方法采用SPSS 22.0软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差()表示，多组比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），进一步两两比较组间均数，方差齐时用LSD法，方差不齐时用Dunnett's T3法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠一般表现CLP造模手术后，除假手术组外，给药前其他各组大鼠均出现精神萎靡、竖毛、眼角分泌黏液等脓毒症模型症状。给药后乌司他丁组、中药高剂量组与中药低剂量组相应症状减轻。

2.2血清中各相关指标检测结果表1结果显示：与假手术组比较，模型组IL-6、LPS、iFABP水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，乌司他丁组，中药高、低剂量组IL-6、LPS、iFABP水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3肠源性脓毒症大鼠小肠黏膜损伤程度光镜下观察各组大鼠小肠HE染色病理切片，评价小肠组织损伤程度[13]。图1结果显示：假手组大鼠光镜下小肠黏膜结构基本正常，绒毛结构完整，无炎性组织浸润；模型组可见绒毛坏死，黏膜间隙扩大，固有层萎缩，炎性组织浸润严重；乌司他丁组绒毛结构部分被破坏，固有层完整，黏膜间隙较小，炎性组织浸润相对减少；中药高、低剂量组绒毛结构相对完整，黏膜间隙部分扩大，炎性组织浸润相对减少。

2.4小肠组织紧密连接蛋白occludin的表达图2与表2结果显示：与假手术组比较，模型组大鼠小肠组织occludin蛋白表达显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，中药高、低剂量组与乌司他丁组大鼠小肠组织occludin蛋白表达显著上升（P＜0.01）。

表1 各组大鼠血清IL-6、LPS、iFABP水平比较Table 1 Comparison of the serum levels of IL-6，LPS，and iFABP in various groups ()

表1 各组大鼠血清IL-6、LPS、iFABP水平比较Table 1 Comparison of the serum levels of IL-6，LPS，and iFABP in various groups ()

①P＜0.01，与假手术组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较

组别假手术组模型组乌司他丁组中药高剂量组中药低剂量组iFABP[ρ/（pg·mL-1）]611.36±140.59 1447.43±220.49①927.01±194.10③863.14±164.28③940.63±206.32③N8 8 8 8 8 IL-6[ρ/（pg·mL-1）]76.59±12.99 115.34±13.91①90.17±18.79③96.65±19.75②85.05±8.04③LPS[J/（EU·mL-1）]5.25±0.64 8.82±0.74①6.10±0.41③7.51±0.86③5.78±0.97③

图1 各组大鼠小肠组织光镜下HE染色病理结果（×100）Figure 1 Comparison of the pathological features of small intestine tissues in various groups by HE staining under light microscope（×100）

图2 各组大鼠肠黏膜occludin蛋白表达比较（免疫组化，×400）Figure 2 Comparison of the expression of occludin in intestinal mucosa of various groups（by immunohistochemistry， ×100）

表2 各组大鼠肠组织紧密连接蛋白occludin表达量比较Table 2 Comparison of the expression quantity of tight junction protein occludin in small intestine of various groups ()

表2 各组大鼠肠组织紧密连接蛋白occludin表达量比较Table 2 Comparison of the expression quantity of tight junction protein occludin in small intestine of various groups ()

①P＜0.01，与假手术组比较；②P＜0.01，与模型组比较

occludin蛋白（p/%）46.65±1.95 22.62±2.89①42.69±2.57②41.48±3.02②44.14±2.62②组别假手术组模型组乌司他丁组中药高剂量组中药低剂量组N8 8 8 8 8

3 讨论

肠源性脓毒症通常是由于一定原因造成肠黏膜屏障的防御机制被破坏，细菌和内毒素通过受损部位进入血液循环导致全身炎症反应综合征（SIRS）。随后，机体免疫反应失调造成各器官功能开始恶化，最终形成多器官功能障碍综合征（MODS），严重时会发生感染性休克或死亡[14]。其发病机制包括肠道微生态紊乱、肠黏膜屏障受损和机体免疫功能障碍等[15]。因此，对受损肠黏膜屏障功能的保护和改善是治疗肠源性脓毒症的有效途径之一。

正常生理状态下，LPS与肠型脂肪酸结合蛋白（iFABP）外周血含量微乎其微，检测血中LPS和iFABP含量即可反映肠黏膜屏障功能的受损程度[16，17]。IL-6能打破抗炎平衡状态并放大炎症反应进程和毒性作用，造成肠黏膜等组织细胞损伤，血中IL-6含量在判断脓毒症严重程度时具有标志性的作用[18，19]。在病理状态下，紧密连接蛋白产生收缩，细胞间隙显著扩大，致使细菌、内毒素等有害物质扩散，肠黏膜屏障功能受到严重破坏[20]。本实验结果表明调胃承气汤能显著改善脓毒症大鼠模型血中LPS、iFABP与IL-6含量的异常，具有修复紧密连接的作用。

临床中烧伤、手术或有严重创伤的患者由于容易受到细菌等有害物质感染，引起机体产生炎症级联反应而发展成为脓毒症[21]。胃肠道通常最先受到炎性因子攻击，从而给肠黏膜细胞带来严重的杀伤性，破坏紧密链接蛋白的黏膜屏障作用，使其屏障功能降低。大量细菌与LPS通过受损肠黏膜进入血液循环，如此往复循环造成严重免疫失调，最终导致脓毒症休克甚至死亡等严重后果[2]。本研究结果提示，调胃承气汤能上调紧密连接蛋白occludin的表达，修复肠组织紧密连接蛋白，有效地改善与保护肠黏膜组织结构，抑制细菌和LPS的进一步扩散，从中间环节阻止了炎症反应的放大，进而减少了IL-6等炎性因子对各器官功能的损伤。因此，调胃承气汤对肠源性脓毒症大鼠肠黏膜屏障功能具有一定的保护作用，其机制可能与上调occludin蛋白的表达有关。