青海世居藏族载脂蛋白E基因多态性与脑血管病的关系☆

吉维忠 吴世政○☆ 侯倩 董晶晶

研究发现，ApoE基因多态性[1]与脑血管病之间存在密切关系，希腊和马来西亚关于ApoE基因多态性与脑卒中关系的研究[2-3]均显示，ε3是常见的致病基因，其次是ε4等位基因和ε2等位基因。本研究的目的在于明确青海世居藏族人群脑血管疾病与ApoE基因多态性的相关性，阐明ApoE基因型在藏民族中的分布规律。

1 对象与方法

1.1 研究对象 连续收集来自青海省人民医院、青海省果洛藏族自治州人民医院、青海玉树藏族自治州人民医院2016年2月至2017年6月神经科住院的脑血管病患者作为研究对象。

1.1.1 纳入标准 ①实验组患者均符合全国第四届脑血管病学术会议的诊断标准[4]；②年龄18～80岁；③所有入组病例均为青海地区世居藏族人群；④经过头颅CT或MRI影像学检查；⑤签署知情同意书。

1.1.2 排除标准 ①非藏民族脑血管病患者；②蛛网膜下腔出血及血管畸行导致的出血；③患有心血管疾病、肝肾功异常、血管性痴呆及阿尔兹海默病等病例；④伴有严重并发症的病例；⑤酗酒、精神类药物滥用史者。

1.2 方法

1.2.1 临床资料采集 所有纳入病例均采集一般资料、既往史、临床体征、心电图、实验室常规、生化检查、头颅影像等资料。

1.2.2 分组 ①脑血管病：青海藏族脑血管病患者94例，其中脑梗死患者48例（cerebral infarction,CI组，男 24例，女 24例）；脑出血患者 46例（intracerebral hemorrhage,ICH组，男20例，女26例）。②对照组：选取青海省藏族健康人群96名，（男52名，女44名）来自青海省人民医院2016年2月至2017年6月健康体检者。

1.2.3 提取外周血DNA①采集血样于连盖管中，加入预混溶液，静置 10～20 min；② 加入 350 μL的缓冲液BD，混匀；③将吸附柱置于收集管内，离心30 s，加入缓冲液GDB，离心30 s；④向吸附柱中加入 60 μL漂洗液 PWB，离心 30 s，再次将吸附柱置于收集管中，重复以上步骤 ；⑤将吸附柱放置于室温下2 min，晾干；⑥将吸附柱转置入1.5 mL离心管中，并且向吸附膜上悬空滴入洗脱缓冲液 TB 20～200 μL，室温放置 2 min，离心 2 min；⑦连盖离心管置于-20℃冰箱保存。

1.2.4 实时定量PCR检测 ①将PCR反应管放置在仪器槽并记录放置的相应顺序；②DNA的扩增；③用PCR仪的程序计算循环数阈值 (CT)；④用扩增曲线的线性视图来确定最先可见的扩增（一般起始设定为3，终止设定为15）；⑤设定荧光阈值，将阈值划定在扩增曲线对数形式下指数增长期的中期。

1.2.5 基因型的判定标准 本实验通过检测位于526位和第388位上的两种单核苷酸多态性来判定ApoE基因型，当388位上的单核苷酸为T以及526位上的单核苷酸为C时，可判定基因型为E3；当388上单核苷酸为T以及526位上单核苷酸为T时，判定基因型为E2；当388上单核苷酸为C及526位上单核苷酸为C时，判定基因型为E4。PCR扩增后通过观察FAM和VIC通道上Ct值进行判定。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计学分析。分类资料间比较用χ2检验，计量资料均以（x±s）表示，组间比较用独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般资料及血脂的比较

2.1.1 脑血管病组年龄、性别、受教育年限分布脑梗死组（CI组）48 例、年龄（61.39±10.48）岁，脑出血组（ICH 组）46 例，年龄（63.17±10.92）岁。 对照组 96例，年龄（65.15±9.61）岁，两组无统计学差异(P＞0.05)。脑血管病男44例，女50例，对照组男52例，女44例，两组无统计学差异(P＞0.05)。脑血管病组受教育年限为（10.56±3.28）年，对照组为（11.39±2.67）年，两组无统计学差异(P＞0.05)。

2.1.2 基因型与血脂的相关性 分别对CI组、ICH组和对照组的血清脂蛋白谱进行方差分析。结果显示，除了TC的组间比较无统计学意义,其余3种血脂脂蛋白谱组间比较均有统计学差异（见表 1）。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验 ApoE基因型的分布频数根据Hardy-Weinberg平衡检验定律，用（p+q+r）2=p2+q2+r2+2pq+2pr+2qr计算载脂蛋白 E各基因型理论频数，其中E2/2=p2，E3/3=q2，E4/4=r2，E2/3=2pq，E2/4=2pr，E3/4=2qr。其中 p 为 ε2 的频率，q为ε3的频率，r为ε4的频率。对其理论频数和实际频数行优度卡方检验(P＞0.05)，差别无显著性，说明上述研究对象均符合Hardy-Weinberg平衡，本研究纳入的样本具有群体代表性。

2.3 ApoE基因测序结果分析

2.3.1 脑血管病组与对照组基因型分布 通过检测位于526位和第388位上的两种单核苷酸多态性来判定ApoE基因型，实验后，通过FAM及VIC通道读出的E3/E4基因型。本实验主要通过检测位于第526位和第388位上的两种单核苷酸多态性来判定ApoE基因型，当388位上的单核苷酸为T以及526位上的单核苷酸为C时，可判定基因型为E3；当388上单核苷酸为T以及526位上单核苷酸为T时，可判定基因型为E2；当388上单核苷酸为C及526位上单核苷酸为C时，可判定基因型为E4。PCR扩增后主要通过观察FAM和VIC通道上Ct值进行判定。

2.3.2 CI组、ICH组与对照组的ApoE等位基因频率及基因型 CI组以ε3等位基因组最常见，为48.0%，其次是ε2（37.5%）等位基因，最少见的是ε4（14.6%）；在ICH 组最常见的是 ε2（43.5%）、ε3（45.7%)等位基因，最少见的是 ε4（10.9%）。 在藏族脑血管病患者中ε3是最常见的等位基因。在正常对照组里，ε2（49.0%）为最常见的等位基因，其次是 ε4（33.3%），ε3（17.7%）为最少见的。 对 3 组的基因频率分布进行比较，差异有统计学意义（χ2=24，P=0.02）。 CI组和 ICH 组等位基因比较无统计学差异（ χ2=0.49，P=0.09）。

CI组和ICH组中E2/E3基因型分布最多、最常见，其次为 E2/E4、E3/E3，最少见的是 E3/E4，本研究并未见到E2/E2、E4/E4两种纯合子基因型；对照组主要以E2/E4基因型最常见，其次为E2/E3，最少的为E3/E4基因型，未见到E2/E2、E3/E3、E4/E纯合子基因型（见表2）。

3 讨论

脑血管病严重威胁着人类生命健康，除了常见的原因外，遗传因素也是脑血管疾病发病原因之一。近年来研究发现，分布在云南少数民族，如佤族、纳西族、白族、彝族，新疆的维吾尔族，以及国外的希腊、赞比亚、日本等民族也存在脑血管病基因差异性[5-6]。中国汉族ApoE基因频率分布也有特点[7]。本研究主要探讨青海藏族人群脑血管疾病和ApoE基因多态性之间的关系，为青海藏族人群脑血管疾病的病因及预防提供依据。

3.1 ApoE的结构与血脂 研究发现ApoE基因多态性与脑血管病、阿尔兹海默病等均有相关关系[8-9]。ApoE的生理功能主要包括[10]神经修复与免疫调节。研究显示：ApoE基因多态性是影响脂类代谢的原因[11]，ApoE基因多态性最终改变循环胆固醇水平[12]。马飞煜等[13]研究显示：在脑梗死患者中发现，携带ε4等位基因患者的LDL-C明显高于ε3基因的携带者，同时在与对照组的研究中发现，E3/4组患者LDL-C显著高于对照组。傅清晰等[14]对重庆男性人群研究发现携带ApoE2表型患者TC水平相对其他携带表型的患者更低，ApoE4表型携带者的TC水平更高。孙赞等[15]通过对50例冠心病患者和156例健康对照者的载脂蛋白基因和血脂水平的测定，结果发现健康组中E3,E4等位基因携带者的TG、LDL水平明显高于E2等位基因携带者。

表2 CI组、ICH组与对照组基因型及ApoE等位基因频率的分布

本研究发现ε3等位基因在藏族脑血管疾病中频率较高，突变基因ε4较少，基因型表现则以E2/E3最常见，这与前面学者研究发现有所不同，例如，研究显示[16]，云南少数民族纳西族脑血管疾病患者中，主要是E3/E3基因型最常见，同时ε3也是脑血管疾病的保护因素。而国内汉族ApoE基因多态性研究发现，在汉族人中，ε3频率最高，约为 83%～85%，ε4频率约为 5.7%～12.9%，ε2约为4%～10%。这与我们的研究一致。

3.2 ApoE基因与脑血管疾病相关性 研究显示，ApoE4等位基因与缺血性脑血管疾病的发生、发展有密切关系[17-18]。如刘红娟等[19]研究发现：在汉族人群中，脑梗死患者的ε2和ε4的频率分别为6.9%和9.7%，而对照组这两个等位基因的频率分别为19.1%和3.9%；卢红艳等[20]通过对50例脑出血患者和120名健康对照组的健康人比较，在ApoE基因型和基因频率的检测中并未发现E4等位基因与脑出血有较大的相关性。LIN等[21-22]发现在不同梗死类型间，ApoE基因型的分布不同并发现ApoE基因多态性与腔隙性梗塞无关[23]。谢爱玲等[24]行meta分析后发现携带ε4基因型的个体发生动脉粥样硬化性脑梗死风险显著增加。刘群等[25]进行前瞻性研究后发现，ApoE等位基因在脑血管疾病的归因危险比例大于冠心病的归因危险发病的风险。NAKATA等[26]的一项meta分析认为ApoE等位基因是CI的危险因素，而等位基因对CI具有保护性。

本研究发现，在脑血管病组以ε2、ε3等位基因组成的E2/E3基因型为主，而健康对照组中，ε2、ε4等位基因组成的E2/E4基因型为主，提示E2/E3可能为脑血管疾病发病的易感因素，而E2/E4等位基因可能为脑血管疾病的保护因素。 高原地区的低压缺氧环境可能是ApoE基因型突变的相关因素，但是具体原因尚不明确，有待进一步研究。另外，脑出血和脑梗死可能存在遗传背景差异，但本研究中未能区别分析，而且数目偏少，存在不足，今后的研究中需要增加数量，进一步分析不同脑血管病的不同遗传特点。