急性脊髓损伤患者血清蛋白质组学研究

高 瑞，杨成伟，王伟恒，周许辉

海军军医大学附属长征医院骨科，上海 200003

急性脊髓损伤（SCI）是脊柱外科的常见疾病之一［1］。目前尚缺乏有效、特异性的实验室检查手段或评估指标。SCI后的病理过程可分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤是指椎体或椎间盘等对脊髓造成的直接压迫，继发性损伤是指在原发性损伤后脊髓出现出血和炎性反应［2］。目前脊髓继发性损伤的病理生理机制和生物化学通路尚未完全明确［3］。近年来，蛋白质组学技术已经广泛应用于各种疾病的标志物检测研究，本研究采用非标记相对定量蛋白质组学（labelfree）技术比较急性颈部SCI患者和健康人群血清蛋白质谱，对差异表达的蛋白进行生物信息学分析，以期发现急性SCI后的重要差异表达蛋白。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2013年7月—2014年12月，收集9例急性颈部SCI患者（伤后24 h内）作为病例组，收集9例性别、年龄与病例组相匹配的健康体检者作为对照组。病例组均为男性，年龄32 ～ 55岁，平均47岁，记录患者损伤时间，并进行颈椎日本骨科学会（JOA）评分［4］。对照组也均为男性，年龄31 ～ 54岁，平均44岁。2组患者均无恶性肿瘤、自身免疫病及慢性传染病等疾病。

1.2 仪器及主要试剂

酶联斑点分析仪（CTL公司，美国）；Q-Exactive液相色谱-质谱联用系统（Thermo公司，美国）；EASY-nLC1000纳升级流速高效液相色谱系统（Thermo公司，美国）；去除人14种高丰度蛋白的多重亲和排除系统（Aligent公司，美国）；胰蛋白酶（Promega公司，美国）。

1.3 血液样本收集和血清蛋白处理

患者伤后送入急诊时即用肝素抗凝采血管收集其空腹静脉血液，4℃离心（1 500 r/min，离心半径19.5 cm，10 min）。每3份血清样本随机合并，作为一个生物学重复，每组3个重复。取血清样品，去除血清中高丰度蛋白，将低丰度蛋白超滤浓缩。浓缩后加入适量裂解液，沸水浴15 min，定量后，-80℃保存。每份样品取200 µg，加入二硫苏糖醇（DTT）至浓度为100 mmol/L，4℃离心（8 000 r/min，离心半径19.5 cm，10 min），离心2次后加入0.5%胰蛋白酶40 µL，37℃孵育18 h。

1.4 液相色谱-串联质谱分析

按定量结果取3 µg酶解产物进行液相色谱-串联质谱分析，采用EASY-nLC1000纳升级流速高效液相色谱系统进行分离。经液相分离后用Q-Exactive液相色谱-质谱联用系统进行质谱分析。分析时长为120 min，检测方式为正离子，母离子（m/z）扫描范围为300 ～ 1 800。

1.5 非标记分析和生物信息学分析

将液相色谱-串联质谱原始文件导入Maxquant 1.3.0.5软件进行非标记定量分析，数据库为ipi.human.3.68.fasta。所得的查库文件使用Perseus 1.3.0.4软件进行分析。获得的差异表达蛋白在基因本体论（GO）数据库进行注释分析，包括细胞组分、分子功能和生物学过程分析。在京都基因与基因组百科全书（KEGG）软件进行通路分析。采用Cytoscape 3.2.1软件的BiNGO 3.0.3插件进行富集分析。

1.6 统计学处理

使用SPSS 16.0软件对数据进行统计学分析。组间各血清蛋白质平均丰度的差异比较采用独立样本t检验，以检验结果P ＜ 0.05或差异倍数＞ 2的蛋白被认为是差异表达蛋白。采用Spearman相关分析探讨差异表达蛋白与年龄、损伤时间以及JOA评分的相关性。

2 结 果

2.1 基本信息

病例组9例患者损伤时间为3 ～ 24（16.4±3.1）h，颈椎JOA评分为6 ～ 13（9.2±1.7）分。

2.2 差异表达蛋白

共发现483个蛋白，其中22个蛋白呈现差异表达。与对照组相比，病例组中有11个蛋白表达上调，包括果糖-二磷酸醛缩酶、碳酸酐酶等；11个蛋白表达下调，包括免疫球蛋白等（表1）。

2.3 差异表达蛋白与损伤时间及JOA评分的关系

Spearman相关分析结果显示，11个表达上调蛋白与损伤时间和颈椎JOA评分呈正相关；11个表达下调蛋白与损伤时间和颈椎JOA评分呈负相关（表1）；22个差异表达蛋白均与损伤时年龄无关。

2.4 生物信息学分析

GO和BiNGO分析结果显示，22种差异表达蛋白主要参与碳酸盐转运、碳酸酐酶活性、B细胞受体信号通路及细胞活化过程（表2），主要富集于大分子复合物、细胞外区、细胞膜、细胞器及膜封闭腔（表3）。将所有的差异表达蛋白进行KEGG通路分析，共发现了4个有统计学意义的代谢通路：果糖和甘露糖代谢通路、血小板激活代谢通路、黏附连接代谢通路和氮代谢通路。

表1 差异表达蛋白与损伤时间、JOA评分的相关性Tab. 1 Correlation analysis between differentially proteins and time of injury，JOA score

表2 GO分子功能分类Tab. 2 GO molecular functional classification

表3 GO细胞成分分类（2级）Tab. 3 GO cellular component classification（Level 2）

3 讨 论

本研究通过研究颈部急性SCI（24 h内）患者与健康人群血液中蛋白质组的差异，筛选出22个表达差异的蛋白质，其中11个蛋白表达上调，且与损伤程度（JOA评分）及损伤时间呈正相关；11个蛋白表达下调，且与损伤程度（JOA评分）及损伤时间呈负相关。并且这些差异表达蛋白主要富集在果糖和甘露糖代谢通路、血小板激活代谢通路、黏附连接代谢通路及氮代谢通路。

关于SCI后继发性损伤的机制目前有几种假说：脊髓微循环障碍机制、免疫炎性反应机制、兴奋性氨基酸毒性机制、氧自由基过氧化反应损伤机制、钙离子内流机制等。有多种细胞因子参与上述机制过程，SCI可改变相关蛋白的表达，并将这些蛋白释放到血液中［5］。

研究发现，SCI会刺激机体发生自身免疫反应，参与反应的细胞有淋巴细胞、中性粒细胞、抗原提呈细胞及吞噬细胞等。这些细胞在SCI后被激活，释放炎性介质和细胞因子来攻击靶细胞。SCI后的脱髓鞘反应能激活T细胞，使T细胞表面产生大量的细胞黏附分子，从而易于进入血脑屏障来抑制轴突坏死［6］。而B细胞在SCI后的增殖和活化受到抑制，具体表现为外周血B细胞数量减少，非胸腺依赖性B细胞活化受到抑制［7］。本研究也发现黏附连接代谢通路激活，而B细胞受体信号通路受到抑制，与上述研究结果一致。

本研究发现果糖和甘露糖代谢相关蛋白表达上调，果糖和甘露糖代谢途径异常激活，说明SCI时中心代谢明显增强，这与既往报道一致［8-10］。SCI可以引起严重的病理生理反应，包括炎性反应、代谢失调和线粒体损伤，而能量损失与神经损伤相关。推测该代谢通路的激活可以归结于SCI后细胞缺乏能量所致。Carpenter等［11］发现，在果糖和甘露糖代谢通路中，神经元可以利用乳酸作为底物产能。Yan等［12］根据GO分析的结果发现SCI后大部分差异表达蛋白为能量代谢酶。Chen等［13］进一步发现急性SCI后糖酵解途径中的果糖-二磷酸醛缩酶会明显升高，且这种酶对神经元有保护作用。此外，碳酸酐酶家族在急性SCI后表达异常升高，考虑和脉管系统的破坏密切相关［3］。

SCI早期会出现脊髓灰质周围的出血、低灌注、微血栓形成，白质部位髓鞘肿胀。损伤刺激会导致血小板活化因子释放增多，在SCI的炎性反应和继发性损伤中发挥毒性作用［14］。肖建如等［15］按损伤程度对SCI患者进行分组及动态观察，发现各组患者的全血血小板活化因子均有不同程度升高，持续至伤后7 d，全血血小板活化因子含量增高和损伤程度呈正相关。本研究同样发现，和对照组相比，SCI患者的血小板激活代谢通路表达活跃。

急性SCI还会诱导机体的免疫细胞产生大量一氧化氮合酶，而一氧化氮被认为在继发性SCI发生机制中起着重要作用。SCI发生后一氧化氮的合成逐渐增加，至伤后12 h达到高峰［16］。本研究亦发现急性SCI后氮代谢通路异常活跃，侧面印证了上述报道。

本研究并没有发现氧化应激蛋白或轴突生长相关蛋白的表达异常，这可能和本研究选取的时间点较早（损伤后24 h之内）有关。据报道，急性SCI中重要的氧化应激蛋白之一谷胱甘肽S转移酶一般在伤后24 h出现，而与轴突生长相关的蛋白出现得更晚一些［3，17］。

综上，本研究通过对急性SCI患者及健康人群的血清蛋白质组学进行分析，发现急性SCI后果糖和甘露糖代谢通路、血小板激活代谢通路、黏附连接代谢通路及氮代谢通路活跃，B细胞受体信号代谢通路则受到抑制。果糖-二磷酸醛缩酶、碳酸酐酶等有望成为急性SCI潜在的分子标志物，为后续评估急性SCI病情进展及病理机制提供了一定依据。