米黑根毛霉脂肪酶基因的酵母重组表达和Kex2位点改造

蔡海莺 沈灵智 赵敏洁 李 杨 毛建卫 冯凤琴*

（1 浙江科技学院生物与化学工程学院 杭州 310023 2 浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心 杭州310023 3 浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 310058）

sn-1，3 专一性脂肪酶是指特异性水解甘油三酯1，3 位酯键的脂肪酶，因其特异性的催化性能，可修饰甘油酯中脂肪酸的组成和分布，是酶法合成功能性结构脂的关键原料之一，已被广泛应用于1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯 （OPO）、类可可脂、1，3-甘二酯和易消化中链脂肪酸结构脂[1-2]。米黑根毛霉脂肪酶（RML）具有较高的比酶活性、热稳定性、溶剂耐受性以及很好的sn-1，3位置专一性等一系列适合工业化推广的特点，因而备受青睐[1]，该基因米曲霉宿主异源表达的重组脂肪酶应用范围最广[3]。诺维信公司固定化的RML 脂肪酶RM IM 在母乳化结构油脂OPO 的酶法合成应用中，展现出极佳的合成效率和市场潜力。然而，该酶制剂价格较高，限制了其在食品工业和油脂加工中的进一步发展。

随着生物学技术水平的提高，通过生物工程方法对脂肪酶进行表达和分子改造，是目前常用的降低酶生产成本的策略之一[4-5]。巴斯德毕赤酵母（Pachia pastoris）表达系统因其高效表达和分泌，易于基因工程改造，培养发酵操作体系成熟等优点，已成为目前使用最广泛的真核表达系统[6]。相较于大肠杆菌表达系统，具有更高的安全性，以及更好的蛋白翻译后糖基化修饰能力等。在巴斯德毕赤酵母中获得成功表达的重组蛋白超过600种，其中，Werten[7]通过蛋白酶缺陷株表达明胶，实现了巴斯德毕赤酵母最高的分泌蛋白表达水平14.8 g/L；Hasslacher 等[8]1997年对热带橡胶的羟基腈裂解酶在巴斯德毕赤酵母细胞内进行表达，最终胞内该异源蛋白表达水平达到惊人的22 g/L，为胞内可溶性蛋白的50%以上，是目前已报道的最高的巴斯德毕赤酵母重组表达蛋白。工业化水平的巴斯德毕赤酵母重组表达已较为成熟。

外源基因的重组表达往往需要进行基因优化和设计，以获得更理想的重组表达水平[9]。蛋白的分子改造过程是提高酶的催化性能和稳定性等特征的有效手段，分子改造的策略包括定向进化、理性设计和半理性设计[10-11]。对RML 脂肪酶氨基酸序列的分析表明，成熟肽196 和197 氨基酸残基（RML 前体全序列的第291 和292 位）为“-Arg-Arg-”，是潜在的Kex2 酶切位点，可能导致脂肪酶蛋白在毕赤酵母重组表达过程中被宿主裂解。本研究利用巴斯德毕赤酵母重组表达系统，结合密码子优化策略，对表达sn-1，3 专一性脂肪酶RML进行重组表达。在此基础上，通过对脂肪酶RML的分子改造和修饰，研究该蛋白内部潜在Kex2 蛋白酶酶切位点对其在巴斯德毕赤酵母中重组表达的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌株和质粒：大肠杆菌 （Escherichia coli）TOP10F’和质粒pUC57，苏州金唯智公司。

重组表达宿主巴斯德毕赤酵母 （P.pastoris）GS115（His-Mut+）和表达载体pPIC9K，美国Invitrogen 公司。

1.2 基因合成及表达载体构建

RML 基因的前导肽和成熟肽由Kex2 识别序列（-KREAEA-）连接。C 端His Tag 用于RML 检测。巴斯德毕赤酵母密码子使用频率数据库（http：//www.kazusa.or.jp/） 用于RML 脂肪酶基因（Gen-Bank：A02536.1）优化，使目的基因GC 含量接近巴斯德毕赤酵母整体平均GC 含量 （42.73%），同时避免GC 或AT 局部含量过高以及影响克隆的限制性内切酶识别位点。最终获得RML 的优化基因命名coRML，该基因序列通过重叠延伸PCR（Splicing by overlap extension，SOE）法合成，并克隆到表达载体pPIC9K 的多克隆位点EcoR I/Not I，得到coRML 基因表达载体pP-coRML。

1.3 表达载体定点突变

coRML 定点突变基因通过二步法全质粒定点突变方法完成[12]，coRML 定点突变基因RM-Q、RM-H 和RM-S 对应的定点突变引物分别为RMQF1 和 RMQR1、RMHF1 和 RMHR1 以 及RMSF1 和RMSR1，引物序列见表1。coRML 定点突变基因以质粒pP-coRML 作为模版。通过二步法PCR 反应扩增，电泳检测PCR 反应结果。加入DpnI 酶和反应缓冲液对PCR 反应产物模板DNA做消化处理，37 ℃处理2 h。通过电泳切胶回收特异性扩增片段（10 kb 处条带），回收产物预冷后加入大肠杆菌感受态细胞，热激转化、复苏后涂板于LBA 平板，37 ℃过夜培养，挑2～3 个单菌落LB 液体培养基中培养过夜后提质粒，通过对质粒测序，确定符合预期的突变体克隆。各表达载体的酵母菌株简称为GS-对应基因名，如pP-RM-Q 转化菌株命名为GS-RM-Q 等。

表1 PCR 引物和定点突变引物列表Table1 Lists of primers for PCR and site directed mutation

1.4 表达载体的巴斯德毕赤酵母转化和筛选

巴斯德毕赤酵母GS115 电穿孔法感受态细胞制备后，冰上放置，用于酵母转化。表达载体质粒经过Sac I 线性化后进行巴斯德毕赤酵母电转化。仪器采用MicroPulserElectroporator 电转化仪（美国伯乐），选择真菌默认参数。转化后向细胞悬液加入1 mL 1 mol/L 山梨醇溶液，利用MD 平板在28 ℃培养箱培养48 h 筛选。pPIC9K 载体作为阴性对照。对MD 平板筛选到的转化子，用不同质量浓度（1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL）G418 遗传霉素的YPD 平板进一步筛选，以获得含多拷贝基因转化子。含100 μg/mL 罗丹明B 的BMMY 平板用于脂肪酶活性菌株的筛选，选择紫外光下具有较大荧光圈的菌株，用于后续脂肪酶的诱导表达和检测。

1.5 重组菌株的诱导表达和脂肪酶酶活测定

重组菌株接种于BMGY 培养基，28 ℃转速250 r/min 摇床培养，到OD600为2.0～4.0 之间。离心收集细胞，用无菌生理盐水清洗2 次，用100 mL BMMY 培养基重悬细胞，调节菌体OD600至1.0。28 ℃，250 r/min 甲醇为碳源培养并诱导菌体进行脂肪酶表达，每隔24 h 取样，同时补加甲醇维持甲醇体积分数1.0%，酵母持续诱导发酵156 h。取样发酵液离心，收集上清液作为粗酶液，用于蛋白和酶活检测，脂肪酶酶活的测定方法采用对硝基苯棕榈酸酯（pNPP）底物法[13]。

1.6 RML 蛋白检测和性质鉴定

诱导表达的胞外蛋白通过SDS-PAGE 电泳检测。凝胶分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4%，考马斯亮蓝R250 用于染色。酶的性质鉴定中所有样品脂肪酶浓度调整到100 U/mL。比较同种体系下，不同温度（20～70 ℃）下pNPP 水解活性，鉴定该脂肪酶的最适温度。脂肪酶热稳定性试验在不同处理温度（40～70 ℃）下温浴5 h，根据脂肪酶残留水解酶活进行鉴定。最适温度和温度稳定性以百分数形式表示。另外，采用薄层层析色谱分析重组RML 催化三油酸甘油酯的水解产物，鉴定其sn1-3 专一性。非位置专一性酶对照为本实验室分离的出芽短梗霉脂肪酶。

1.7 蛋白结构模型的构建及结构分析

以PDB 数据库米黑根毛霉脂肪酶（PDB 3TGL）的晶体结构为模板，同源模突变体的蛋白结构，蛋白结构预测采用I-TASSER 方法（Iterative Threading ASSEmbly Refinement）[14]；蛋白突变体的稳定性变化分析通过FoldX 计算氨基酸突变前、后ΔG 值（kcal/mol）变化[15]，计算5 次取最小ΔΔG 值，公式为：

公式（1）中，若ΔΔG 为负，表明势能降低，突变体较野生型结构稳定；反之，表明势能增加，结构不稳定；绝对值表明结构稳定性变化程度。另外，脂肪酶蛋白糖基化位点通过GlycoMod 软件（http：//web.expasy.org/glycomod/）预测。蛋白质结构作图及可视化使用PyMOL 1.3.x 和VMD 软件实现。

2 结果与分析

2.1 RML 脂肪酶基因克隆、表达载体构建

RML 优化后的基因序列见图1。表达载体经测序验证后转化到毕赤酵母GS115 菌株，先后经MD 平板筛选、G418 平板筛选高拷贝转化子和含橄榄油-罗丹明B 的平板功能鉴定，得到具有较大荧光圈的菌株GS-coRML（+编号）作为后续研究。

图1 coRML 和wtRML 序列比较分析Fig.1 Sequence comparison of coRML and wtRML

2.2 RML 脂肪酶诱导表达

RML 转化子菌株经摇瓶发酵诱导表达 （图2），重组菌株对甲醇的适应较快，细胞在短暂的滞后期后迅速进入对数期，水解酶活也随之缓慢上升，直到发酵156 h 达到3.77 U/mL，表达量明显低于许多脂肪酶的巴斯德毕赤酵母重组表达量，表明不同基因对表达水平影响较大。SDS-PAGE电泳结果显示（图3），巴斯德毕赤酵母重组表达的RML 分子质量在32 ku 和60 ku 有条带，32 ku小于理论RML 脂肪酶前体分子质量37.33 ku（含His Tag），为RML 成熟肽，60 ku 大于含前导肽RML 的理论分子质量，RML 仅前导肽上有N 糖基化位点，表明重组脂肪酶有部分前导肽未能切开，并且前导肽部分获得了酵母宿主的翻译后糖基化修饰。许多研究表明糖基化修饰对酵母中重组蛋白的分泌和积累有非常重要的作用[16-17]。N-糖基化修饰可提高蛋白稳定性的可能原因包括：糖链能在一定程度上降低未折叠蛋白的无序度；另外，糖链为较大的亲水基团，有利于蛋白和水分子间氢键的形成，因而增加了蛋白的水溶性，并能抑制蛋白聚集和去折叠。

图2 重组毕赤酵母的RML 生长和酶活曲线Fig.2 Growth and lipase activity curve of RML transformant in the recombinant P.pastoris

图3 重组毕赤酵母的RML 脂肪酶表达Fig.3 Analysis of RML expression in the recombinant P.pastoris

2.3 RML 温度稳定性、最适温度测定

最适温度试验表明（图4a），RML 脂肪酶的最适温度为45 ℃，当温度高于和低于这一温度时，酶活都显著降低，呈现倒V 形，表明RML 酶活对温度较为敏感。另外，RML 脂肪酶的温度稳定性较为一般（图4b），40 ℃处理5 h 仍然能保持基本不变。令人奇怪的是RML 在40 ℃处理有助于酶活的提升，表明最适酶活温度处理可能起到激活脂肪酶的效果。然而，当处理温度高于40 ℃（50，60，70 ℃）时，酶活均下降明显，表明RML 脂肪酶的最适酶活只能达到45 ℃，可能是RML 不太理想的热稳定性所致。

2.4 RML Kex2 酶切位点改造

为了进一步改善RML 脂肪酶的重组表达，本试验通过定点突变的方式去掉潜在的Kex2 酶切位点 （成熟肽196 和197 氨基酸残基 “-Arg-Arg-”）。通过RML 同源序列的比对发现，Arg197残基非常保守，因此仅对Arg196 残基进行改造，参考同源序列，将Arg196 残基（全序列第291 位）突变为Gln、His 和Ser，从而获得突变体RMQ、RMH 和RMS。经FoldX 软件分析，RMQ、RMH 和RMS 较野生型RML 脂肪酶蛋白的最低ΔΔG 值分别为0.06，0.46，2.05 kcal/mol，稳定性较野生型均有所降低。

经4 mg/mL G418 平板筛选高拷贝后，从罗丹明B 筛选平板选出GS-RMQ、GS-RMH 和GSRMS 各4 株具有较大荧光圈的菌株进行摇瓶发酵，发酵诱导168 h 后测定胞外酶活，比较平均酶活，结果见图5所示，RML 突变体酶活均显著低于野生型的RML 脂肪酶，且SDS-PAGE 结果表明蛋白表达量都很低。结果表明“-Arg196-Arg197-”序列并不影响RML 的重组表达。通过对RML 蛋白结构分析，“-Arg196-Arg197-”位于脂肪酶的β折叠上，Arg196 的部分支链位于蛋白表面，而Arg197 残基以及二者形成的肽键，即Kex2 酶切位点的肽键被包埋在蛋白的内部（图6）。因此，包埋在蛋白的内部Kex2 潜在酶切位点 “-Arg196-Arg197-”并不会裂解RML 蛋白和影响其表达，同时表明毕赤酵母Kex2 的酶切修饰过程发生在脂肪酶结构基本折叠完成之后。

图4 重组RML 的最适温度（a）和温度稳定性（b）测定Fig.4 Effect of temperature on RML lipase activity （a） and stability （b）

图5 RML 和其突变体菌株胞外酶活比较Fig.5 Extracellular lipase activity of RML and its variants strains

图6 RML 脂肪酶Arg-Arg 所处位置Fig.6 Position of Arg196-Arg197 in the RML structure

3 讨论

本研究发现RML 的表达量较许多脂肪酶的巴斯德毕赤酵母重组表达明显偏低，平均水解酶活仅为3.77 U/mL，有必要对其重组表达进行优化。为进一步改善RML 脂肪酶的重组表达，本试验通过定点突变的方式去掉潜在的Kex2 酶切位点（成熟肽196 和197 氨基酸残基“-Arg-Arg-”）。结果显示RML 突变体酶活均显著低于野生型的RML 脂肪酶，且SDS-PAGE 结果表明蛋白表达量都很低。由此可见，“-Arg196-Arg197-”序列并不影响RML 的重组表达。通过对RML 蛋白结构分析发现，Kex2 酶切位点的肽键被包埋在蛋白的内部。

另外，分析两种脂肪酶以及毕赤酵母的氨基酸组成发现，RML 蛋白中具有较高比例的脯氨酸残基Pro，在先导肽70 氨基酸残基中含11 个Pro残基，在成熟蛋白区域有13 个Pro 残基，RML 先导肽、成熟蛋白和前体蛋白的大小分别为70，269和339 氨基酸残基，其中Pro 残基的摩尔比例分别达到14.3%，4.8%和7.1%。而毕赤酵母中Pro 出现的频率为4.5%，提示先导肽中Proline 对其结构和功能的意义。由于Pro 的顺反异构化是蛋白质折叠的重要限速步骤之一[18]，如何能使目标蛋白大量表达的同时，保证RML 前体中Pro 残基的正确折叠是后续需要解决的问题。