林木根际细菌JYZ-SD5的促生抗逆性能及种类鉴定

徐秀倩 吴小芹 吴天宇 曾梦嫚

（1. 南京林业大学南方现代林业协同创新中心，南京林业大学林学院，南京 210037；2. 江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室，南京 210007）

土壤微生物群落丰富，各具有不同的生物学功能。植物根际促生菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）生存于植物根际和根表［1］，具有促进植物生长，拮抗病原微生物［2］，提高植物抗性，修复土壤，维持土壤质量健康等功能［3-4］。如PGPR可在植物根际快速繁殖，固定大气中的氮素［5］、使植物充分利用土壤的养分，促进植物更好生长［6］。Liu等［7］从杨树根际筛选出一株荧光假单胞菌（Pseudomonads fluorescent）JW-JS1，可显著促进NL-895杨和美洲黑杨苗木的生长和营养元素含量的提高。宋芳旭等［8］发现根际细菌水拉恩氏菌（Rahnella aquatilis）JZ-GX1对杨树溃疡病菌金黄壳囊孢（Cytospora chrysosperma）的防效可达84%。部分芽孢杆菌属（BacillusCohn）还可提高植物对重金属的耐受性［9］，Kuramshina 等［10］发现 用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）内生菌株处理Sinapis alba种子可提高植物对镉和镍毒性作用的抵抗力，并减少地上部分的伤害表现。

在自然条件下PGPR对植物的有益功能是多方面相互作用的结果，然而目前关于PGPR的研究大多侧重于某个或某些生物学功能，对PGPR综合性能的研究相对较少。本实验室前期从杨树根际分离出一株具有解有机磷和产ACC脱氨酶特性的细菌菌株JYZ-SD5，初步研究表明其对杨树具有一定的促生作用。但关于该菌株更多的生物学功能并不十分清楚，其分类地位也不明确。为深入探讨和弄清该菌的潜在特性和应用价值，本研究进一步对该林木根际细菌JYZ-SD5的促生抗逆性能进行检测，同时展开林木温室促生试验，并确定其分类地位，以期为评估该林木根际细菌JYZ-SD5在野外试验中的应用价值提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 供试根际细菌：实验室前期从山东杨树根际分离出的细菌JYZ-SD5。供试林木病原菌：水杉赤枯病菌：细极链格孢（Alternaria tenuissima）、异角状拟盘多毛孢（Pestalotiopsis heterocornis）；茶树纹叶枯病菌：山茶球座菌（Guignardia camelliae）；茶树轮斑病菌：异色状拟盘多毛孢（Pestalotiopsis vesicolor）；松枯梢病菌：松杉球壳孢（Sphaeropsis sapinea）；杨树溃疡病菌：七叶树壳梭孢（Fusicoccus aesculi）；银杏叶枯病菌：链格孢（Alternariasp.）。所有菌株保存于南京林业大学森林病理学实验室。

1.1.2 植物材料 2年生水杉盆栽实生苗，基质选用南京林业大学北大山林木根际表层土。

1.1.3 供试培养基 牛肉膏蛋白胨（NA）培养基，蒙金娜培养基用于测定菌株溶解有机磷的能力［11］，无氮培养基用于固氮能力定性测定［12］，解钾能力检测培养基［13］，纤维素刚果红培养基用于分解纤维素能力的测定［14］。蛋白质酶检测培养基［15］，金氏培基B（King’S medium B，KB）用于菌株产IAA的测定［11］。

1.2 方法

1.2.1 根际细菌JYZ-SD5固氮、解磷、解钾性能测定 （1）固氮特性检测：将供试菌株采用平板划线的方法接种在无氮培养基中，每个处理3次重复，置于28℃低温恒温培养箱（MIR-553，Japan），连续观察细菌的生长状况。（2）解有机磷特性检测：将供试菌株采用三点接菌的方法接种在解有机磷培养基中，每个处理重复3次，置于28℃培养箱中，连续观察菌落周围透明圈的有无。（3）解钾能力测定：将供试菌株采用液体培养的方法，接种到解钾检测液体培养基中，每个处理重复3次，置于28℃摇床培养，转速为200 r/min，培养数天后，用火焰分光光度计（FP6410，上海）检测细菌的解钾能力（解P1为空白对照，P2为接菌处理）。

1.2.2 根际细菌JYZ-SD5产IAA能力检测 （1）定性检测：挑取单菌落接入金氏培基B中，恒温摇床（Multitron Standard，Switzerland）37℃ 培养 24 h，用无菌枪头吸取1 mL菌液于无菌离心管中，加入4 mL Sackowcki’s 显色剂之后迅速充分混合，室温下避光显色40 min，观察颜色变化。（2）定量检测：精确称取IAA10 mg，先用少量乙醇溶解，再用蒸馏水定容至100 mL（浓度为100 μg/mL），然后分别稀释成 0、4、8、12、16、20、24 μg/mL，取各浓度1 mL，分别加入4 mL显色剂，40℃暗保温40 min，与OD535下测定OD值，绘制标准曲线。将培养的菌悬浮液和空白对照，离心10 min（10 000 r/min）后取上清液4 mL加入等量比色液，在黑暗中静置40 min，取出立即用HexIOS分光光度计（Lamnda365，Korea）测定OD535值，每个样品重复测3次，以加入比色液的空白对照调零，对比标准曲线计算该菌株分泌IAA量，连续测定7 d。

1.2.3 根际细菌JYZ-SD5拮抗林木病原菌活性测定 （1）平板拮抗：供试病原真菌接种于PDA培25℃养基中，每皿接种一块，重复3次，用接种环沾取液体摇培24 h后的菌液，在菌落两侧对称划线，放入培养箱培养，连续观测记录菌株的抑菌效果。（2）胞外代谢产物拮抗活性：获取供试菌发酵液，发酵液移入灭菌50 mL离心管中，10 000 r/mim，4℃离心10 min，取上清液，过细菌滤膜，得无菌胞外代谢产物。将无菌胞外代谢产物按0.5%的比例加入PDA培养基中，摇匀倒平板。将林木病原菌接种于平板中，重复3次，置于25℃培养箱中培养，观察该菌抑菌效果（抑菌率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%）。

1.2.4 根际细菌JYZ-SD5产纤维素酶、蛋白酶测定 （1）纤维素酶检测：将供试菌株采用三点接菌的方法接种在纤维素酶检测培养基中，每个处理重复3次，置于28℃培养箱中，连续观察菌落周围透明圈的有无。（2）蛋白酶检测：将供试菌株采用三点接菌的方法接种在蛋白酶检测培养基中，每个处理重复3次，置于28℃培养箱中，连续观察菌落周围透明圈的有无。

1.2.5 根际细菌JYZ-SD5的重金属耐受性测定 （1）配制NA培养基，分别添加KMnO4、NiCl2.6H2O、K2Cr2O7、CuSO4.5H2O。 使 Mn7+、Ni2+、Cr6+、Cu2+浓度 梯 度 为 5、10、15、20、30、40、50、80、100、200、300、400 mg/L（ 以 纯 Mn7+、Ni2+、Cr6+、Cu2+计），对照为纯培养基。将菌株接种于上述培养基中，放入培养箱中，24 h后进行观察。（2）不同重金属浓度胁迫下菌株JYZ-SD5生长曲线的测定：将菌株JYZ-SD5接种到不同重金属浓度的液体NB培养基中，用微生物全自动生长曲线分析仪（Bioscreen C，Finland），每隔2 h测定不同盐胁迫下的OD600值，并以时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制菌株JYZSD5的生长曲线。

1.2.6 根际细菌JYZ-SD5对水杉促生试验 用接种环挑取单菌落于含有50 mL NA液体培养基的100 mL三角瓶中，28℃、200 r/min振荡培养24 h。获得细菌发酵液，将上述发酵液稀释5倍，施用到2年生水杉盆栽苗中，每株施用50 mL稀释液（菌体量5×108CFU/mL），对照组接种等量摇培24 h后的NA培养基。施菌后实生苗置于室外，在施菌后20 d、40 d后采用手持叶绿素仪（SPAD-502 plus，Japan KONICA MINOLTA 制造公司）测定处理组和对照组相对叶绿素含量并测其苗高和地径。

1.2.7 根际细菌JYZ-SD5的鉴定 （1）菌体形态、特征观察及生理生化指标测定：参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株JYZ-SD5进行生理生化测定，描述菌落形态、特性。（2）16S rDNA基因序列分析及系统进化树：以提取的细菌总DNA为模板，用细菌16S rDNA的一对通用引物（上游引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）， 下 游 引 物1492r（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'） 对 细菌基因组DNA进行扩增。PCR反应体系：mix10 μL，上下游引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，33个循环；72℃延伸10 min。将获得的PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，紫外灯下拍照。有条带则将获得的PCR产物送南京金斯瑞生物技术公司纯化测序。所测得的16S rRNA 与 Ez Taxon 和 Gen Bank中的序列进行基因序列比对，用 MEGA 8.0构建系统发育树。

1.2.8 数据处理 所测数据采用 Excel 2013 软件绘图，用prism cracked软件进行数据统计分析。

2 结果

2.1 根际细菌JYZ-SD5菌株的固氮、解磷和解钾特性

测定表明，根际细菌JYZ-SD5菌株在固氮培养基上可以生长（图1-A），在解有机磷培养基上生长出现透明圈（图1-B），说明该菌具有固氮、解有机磷的能力；同时在解钾能力检测中，发现对照组中钾含量为7.9 μg/mL，处理组中钾含量为11 μg/mL，比对照提高了2.1 μg/mL，菌株JYZ-SD5的解钾能力为39%（表1）。

表1 菌株JYZ-SD5解钾能力测定

2.2 根际细菌JYZ-SD5菌株产IAA能力

采用Salkowski比色法测定表明，在含有色氨酸培养液的比色反应中其颜色为淡红色，说明菌株JYZ-SD5具有一定产IAA的能力。采用标准IAA制作标准曲线定量分析，得出菌株JYZ-SD5培养1 d后在不含色氨酸的培养液中分泌的IAA浓度为3.938 5 μg/mL；在含L-色氨酸的培养液中IAA浓度达到7.152 0 μg/mL，且菌株JYZ-SD5在培养4 d后产IAA量达到最高。在不含色氨酸的培养液中分泌的IAA浓度最高为6.818 6 μg/mL；在含L-色氨酸的培养液中IAA浓度最高为12.199 6 μg/mL（图2）。

2.3 根际细菌JYZ-SD5菌株对几种林木病原真菌的拮抗活性

测定表明，该菌株胞外代谢产物对链格孢、七叶树壳梭孢、异色状拟盘多毛孢的抑菌效果较明显，其中对银杏叶枯病菌链格孢抑菌效果最大，抑菌率为20.22%（表2）。菌株JYZ-SD5与供试林木病原真菌的平板对峙结果表明，该菌株对茶树轮斑病菌异色状拟盘多毛孢，链格孢，茶树云纹叶枯病菌山茶球座菌，水杉赤枯病菌细极链格孢的抑制效果较为明显（图3）。

图2 根际细菌JYZ-SD5的IAA定量检测

表2 根际细菌JYZ-SD5胞外代谢产物对供试林木病原真菌的抑菌率

2.4 根际细菌JYZ-SD5菌株的蛋白酶和纤维素酶活性

菌株JYZ-SD5在蛋白酶检测培养基、纤维素酶检测培养基上出现明显透明圈（图4），表明该菌含有蛋白酶和纤维素水解酶，具有一定的水解蛋白质和分解纤维素的能力。

A：链格孢；B：细极链格孢；C：山茶球座菌；D：异色状拟盘多毛孢。其中，A1-D1为CK；A2-D2为接菌划线处理

图4 根际细菌JYZ-SD5蛋白酶（A）和纤维素酶（B）检测

2.5 根际细菌JYZ-SD5菌株的金属耐受性

该菌在Mn7+、Gr6+存在的供试浓度下均可以生长，耐受浓度最高均可达到400 mg/L，在Ni2+浓度为0-200 mg/L可以较好的生长，在Cu2+浓度为5 mg/L及以上时该菌无法生长。在Gr6+、Ni2+浓度不超过200 mg/L时，该菌与在正常生长条件下时相比无明显差异；在Mn7+存在的情况下，该菌达到稳定期的时间明显推迟，说明Mn7+的存在会抑制该菌的繁殖速度，且当Mn7+浓度在200-300 mg/L时，该菌前30 h生长较好，30 h以后菌体量突然减少，说明在200-300 mg/L浓度下，该菌的耐受性减弱，培养后期会出现大量菌体死亡的现象。综合来看，重金属浓度在0-200 mg/L之间时，该菌对重金属胁迫耐受能力为 Ni2+＞ Gr6+＞ Mn7+＞ Cu2+；当重金属浓度高于200 mg/L时，只能在Mn7+、Gr6+存在的情况下缓慢生长（表3，图5）。

2.6 林木根际细菌JYZ-SD5对水杉的促生作用

施菌处理后，水杉实生苗的苗高和地径相对于对照组均有明显提高。施菌20 d后苗高和地径净增长量均提高了200%左右；施菌40 d后，水杉叶绿素相对含量相对于对照增加了37.8%，苗高和地径的净增长量分别提高了74%和88%，施菌处理和对照处理间存在显著性差异。说明接种根际细菌JYZSD5菌株对水杉的生长有显著的促进作用（图6）。

表3 林木根际细菌JYZ-SD5菌株在不同重金属胁迫下24 h后的生长状况

图5 根际细菌JYZ-SD5在不同重金属胁迫下的生长曲线

图6 根际细菌JYZ-SD5菌株对水杉的促生作用

2.7 林木根际细菌JYZ-SD5菌株鉴定

2.7.1 形态特征及生理生化特性 菌株JYZ-SD5在NA培养基上菌落为近圆形，边缘不整齐，乳白色，菌落中间无凸起，湿润、有光泽（图7-A、7-B）。菌体短杆状，无鞭毛，革兰氏阳性菌，在芽孢染色观察中可看到着绿色的芽孢，说明产芽孢（图7-C）。

图7 根际细菌JYZ-SD5在NA平板上培养24 h后的菌落形态（A、B）及革兰氏染色（C）、芽孢染色（D）结果

菌株JYZ-SD5在VP实验、甲基红实验、吲哚实验、硝酸还原实验中结果呈阳性，可以水解淀粉、明胶。接触酶和氧化酶实验结果为阳性，在糖、醇发酵实验中，葡萄糖产酸检验结果为阳性，苯丙氨酸脱氨酶、木糖、甘露醇检验结果呈阴性（表4），结果与拟蕈状芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）的特征基本相符。

表4 JYZ-SD5菌株生理生化测定结果

2.7.2 16S rDNA序列分析及系统进化树 菌株JYZSD5的16S rDNA扩增产物，用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测结果，在1 500 bp附近有一条明亮的PCR目的条带，且无其他非特异性条带。表明16S rDNA扩增获得的目的DNA片段可用于测序。经测序获得菌株JYZ-SD5的16S rDNA基因有1 420个碱基（GenBank 登录号 ：MH894221）。

通过将菌株JYZ-SD5与 Ez Taxon 和 GenBank 中的序列进行基因序列比对，并将同源性最高、且已定名的模式菌的序列信息，通过 MEGA8.0 软件构建系统发育树（图8），菌株JYZ-SD5与拟蕈状芽孢杆菌NH24A2模式菌株聚在一起，相似性达99%。根据系统发育树相似性分析，结合形态、生理生化特征比对，初步鉴定菌株JYZ-SD5为拟蕈状芽孢杆菌。

图8 基于16S rRNA基因序列构建的JYZ-SD5菌株系统发育树

3 讨论

植物根际细菌一般通过提高植物对根际养分吸收、产生植物激素类物质等促进植物生长［16-17］。从研究结果看，林木根际细菌JYZ-SD5具有固氮、解有机磷和解钾的能力，具有较高的产IAA能力，不加色氨酸前体下产IAA量为6.818 6 μg/mL。Yasmi［18］等发现具有固氮、解磷和产IAA能力的两种细菌Exiguobacteriumsp.和Stenotrophomonassp.对卡琪花蒂玛（Labisia Pumila）有促生作用。本研究通过盆栽试验发现，林木根际细菌JYZ-SD5对水杉有很好的促生作用，能明显提高水杉的株高和地径，施菌40 d后，相对于对照组苗高和地径的净增长量分别提高了74%和88%。说明林木根际细菌JYZSD5存在某种促进植物生长的机制。结合其固氮、解磷、解钾，产IAA的能力分析，推测该根际细菌对水杉的促生机制可能是通过提高植物对土壤氮、磷、钾养分的吸收，同时产生一定的促生物质来实现。

研究证实，部分重金属耐受性较高的根际细菌，在重金属污染地区可修复被污染的土壤，提高植物在污染地区生长状况［19］；如Krishnendu等［20］发现Enterobacter aerogenesK6菌株对 Cd2+、Pb2+和 As3+的耐受性高，并且在镉胁迫下施用该菌，水稻幼苗生长显著增强。本研究发现，根际细菌JYZ-SD5菌株具有良好的耐重金属的能力，对Mn7+、Gr6+的耐受性最高均可达400 mg/L，对重金属Ni2+的耐受最高也可达200 mg/L。并且林木根际细菌JYZ-SD5菌株可以产纤维素酶和蛋白酶，而蛋白酶和纤维素酶能够降解真菌细胞壁中的蛋白质和纤维素，破坏病菌菌丝，使病菌生长受到抑制［21］；同时本实验也证明该根际细菌JYZ-SD5对链格孢的抑菌率可达20.22%，对其他林木病原菌也具有一定的抑菌效果。由此推测JYZ-SD5菌株在重金属污染地区及林木病害防治方面具有较好的应用价值。

林木根际细菌JYZ-SD5经鉴定为拟蕈状芽孢杆菌，属芽孢杆菌属。拟蕈状芽孢杆菌是Liu等［22］2017年通过多相分类学方法，依据表型和16S rRNA基因序列分析数据，认为其属于蜡状芽孢杆菌中的低dDDH和ANI值菌株，而重新被划分出的一个新种Bacillus paramycoidessp. nov. type strain NH24A2T，该新种的模式菌株来自海洋。而本研究中将来自林木根际的菌株JYZ-SD5鉴定为拟蕈状芽孢杆菌，这是该菌分离自陆地生态系统的首次报道。研究结果表明拟蕈状芽孢杆菌JYZ-SD具有较好的促生抗逆特性，具有作为一种新型的微生物菌株资源开发应用的潜力。

4 结论

本研究通过对菌株JYZ-SD5生物学特性进行检测，得到该菌具有固氮、解磷、解钾、产IAA能力，对林木生长具有明显促进作用，对某些林木病原真菌具有一定的拮抗效果，对Ni2+、Gr6+、Mn7+等重金属耐受性较高，并通过形态观察、生理生化特性分析、16S rDNA序列分析将菌株JYZ-SD5鉴定为拟蕈状芽孢杆菌。