不同组成酸化剂对罗非鱼生长性能和抗氧化及肝脏代谢酶活性的影响

■林 雪 段静娜 赵玉蓉 王红权*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；2.广州天科生物科技有限公司，广东广州 510896）

集约化养殖系统中的鱼类面对各种各样环境应激，如高密度养殖条件下的密度胁迫，会引起氧化应激[1-2]；鱼类对水温变化有较强的敏感性，温度应激会导致鱼体产生代谢应激反应[3]；另外，复杂的水环境，如水生态环境恶化，人工捕捞，水体交换差，水中低氧胁迫[4]，金属离子过多[5]等等，都会造成一系列的氧化应激反应[6]；氧化应激是动物机体自由基生成增加或清除能力降低，导致动物机体氧化系统和抗氧化系统功能紊乱，最终引起氧化损伤，代谢酶活性降低，生长受阻[7]。复合酸化剂避免单一酸化剂功能的单一、腐蚀性强、添加量大等缺点，现多取代单一酸化剂应用于养殖行业中，可提高动物抗应激能力[8-9]。复合型酸化剂主要是由多种有机酸复配而成，各种酸之间起协同增效的作用，可提高饲料的适口性及饲料转化率，也可作为防霉剂和抗氧化剂保持饲料品质，同时还可作为代谢调节剂直接被机体吸收，参与体内的物质代谢[10]。有研究表明添加酸化剂对水产动物有一定促进生长性能的作用[11-12]。本试验以罗非鱼幼鱼为研究对象，研究市场上不同配方组成复合型水产酸化剂对鱼类的生长性能、血清和肝脏抗氧化、酶活性效果的影响，为复合型酸化剂在水产饲料上的合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼的罗非鱼由广州番禺鱼种场提供。

酸化剂1（主要成分为甲酸、乙酸和丁二酸），酸化剂2（主要成分为柠檬酸和富马酸），酸化剂3（主要成分为富马酸和丙酸）。

试验的罗非鱼基础饲粮配方及营养水平见表1。以基础日粮(pH值5.36，系酸力52.98 mmol/100 g)为对照组，分别在基础日粮中添加0.2%酸化剂，配制试验1 组日粮（pH 值5.31，系酸力50.97 mmol/100 g）、试验2 组日粮（pH 值5.23，系酸力52.81 mmol/100 g）和试验3组日粮（pH值5.28，系酸力51.83 mmol/100 g）。所有饲料原料先按配方表1称料，先混小料，大原料粉碎后40目过筛，将所有原料在搅拌机中混匀后，边搅拌边慢慢加油，最后用双螺旋挤压成粒径约为1.5 mm的条状饲料，自然风干后-20 ℃冰箱保存备用。

表1 基础日粮组成及营养水平(%)

1.2 试验设计

试验用罗非鱼鱼种运回实验室后在室内循环过滤水族桶中驯养（容积为500 L）两周，待其适应环境后，选取体格相近的健康罗非鱼300 尾[初始体重为（67.40±0.93）g]，随机分成4个处理组，分别为对照组（饲喂基础饲粮）、试验1 组（饲喂添加酸化剂1 的日粮）、试验2组（饲喂添加酸化剂2的日粮）和试验3组（饲喂添加酸化剂3的日粮），每个处理设3个重复桶，每个重复桶放养25 尾鱼。试验水经生化棉过滤，用低压鼓风机加氧。

1.3 饲养管理

试验期间，每天分别在8:00 和16:00 投喂相应饲粮，日投食量为鱼体重的6%左右，投喂1 h 后吸出残饵和粪便，然后换水（约1/3 体积）。每天观察鱼的健康状况，记录死亡情况，饲养周期共35 d。试验期间水温26～30 ℃，pH 值7.0～7.5，NH4+＜0.02 mg/l，亚硝酸盐＜0.1 mg/l，溶氧＞5 mg/l。

1.4 样品采集和指标测定

养殖试验于第36 d结束，禁食24 h后于第37 d取样，以桶为单位称重、记数，计算生长指标。然后每桶随机取6尾鱼，尾静脉取血，离心后取血清置于-20 ℃冰箱保存；冰盘上打开腹腔，取出肝脏用滤纸轻轻吸去水分，迅速称重后储存在-20 ℃冰箱中保存备用。采用南京建成生物工程研究所试剂盒按说明书检测血清和肝脏样中的抗氧化和代谢酶活性指标。其检测指标为：总超氧化物歧化酶(T-SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6PGDH)和异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）。计算增重率、饵料系数和肝体比指标。

增重率(%)=100×(鱼末均重-鱼初均重)/鱼初均重

饵料系数=鱼均饵料摄入量/(鱼末均重-鱼初均重)

肝体比（%）=100×肝脏重/鱼体重

1.5 数据统计分析

采用SPSS 17.0进行数据分析，所有数据以“平均值±标准误”表示。单因素方差分析（one-way ANO-VA）比较各组间差异，Duncan's 法进行多重比较，P＜0.05作为显著性标准。

2 结果

2.1 不同组成酸化剂对罗非鱼生长性能和肝体比的影响（见表2）

表2 不同组成酸化剂对罗非鱼生长性能的影响

由表2可知，不同组成酸化剂的添加影响罗非鱼的末均重、增重率和饵料系数。试验1 组（甲酸+乙酸+丁二酸）末均重显著高于对照组和酸化剂试验3组（富马酸+丙酸）（P＜0.05）；而酸化剂试验2组（柠檬酸+富马酸）增重率，显著高于酸化剂试验3 组（P＜0.05）。

与试验3 组相比，试验1 组和试验2 组饵料系数显著降低（P＜0.05），但两组之间差异不显著（P＞0.05）

与对照组相比，酸化剂试验1 组的肝体比降低4.00%，酸化剂试验2组的肝体比提高11.11%，而酸化剂试验3 组的肝体比提高了2.22%，但各组间的肝体比差异不显著（P＞0.05）。

2.2 不同组成酸化剂对血清和肝脏生化指标的影响(见表3、表4)

表3 不同组成酸化剂对罗非鱼血清生化指标的影响

由表3可知，与对照组、酸化剂试验1组和试验3组相比，酸化剂试验2组显著提高血清的总抗氧化能力（T-AOC）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）（P＜0.05）；但是酸化剂的添加并未显著改变血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）和丙二醛（MDA）的含量（P＞0.05）。

表4 不同组成酸化剂对罗非鱼肝脏生化指标的影响

由表4可知，与对照组相比，试验1组和试验3组显著降低肝脏T-AOC；但是，不同组成的复合酸化剂对肝脏T-SOD、MDA、ACP、AKP、异柠檬酸脱氢酶（ICDHc）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6PGDH）并未有显著影响（P＞0.05）。

3 讨论

在饲料中加入酸化剂，可使其胃肠道pH值下降，保证消化酶在正常pH 值环境下发挥酶活性，从而提高饲料中蛋白质、矿物质和维生素的消化率[8]，并且有一定的诱食和促生长效果[9，13]。而复配酸化剂总酸含量高，各成分间协同增效作用强，降低胃肠道pH 值，起到抑菌杀菌作用，并且其中某些有机酸是机体代谢的中间产物，可直接参与机体中的物质代谢，可被直接吸收利用。尚卫敏等[11]发现添加乳酸、柠檬酸和复合酸显著改善草鱼增重率与饲料转化率；潘庆等[14]也发现在饲料中分别添加0.3%柠檬酸、乳酸也能提高罗非鱼幼鱼的生长性能，但0.3%富马酸反而降低罗非鱼对饲料的利用。本研究中，不同配伍酸化剂对罗非鱼生长性能的影响存在差异，甲酸+乙酸+丁二酸和富马酸+柠檬酸的复合酸化剂配伍与对照组相比都促进罗非鱼的生长，提高饲料转化率，而富马酸+丙酸的配伍则并未发现该效果，一是由于酸降低了饲料的pH 值，二是由于酸的抑菌抗菌作用。而酸类酸化日粮的能力强弱甲酸＞苹果酸=柠檬酸＞乙酸。并且每种酸都有其独特的pK 值，定义为酸50%解离时的pH值。pK值越大，酸解离越难。甲酸pK值为3.77，杀菌抑菌效果非常明显。任何一种酸调节肠道菌群结构都需要在一定的pH 值范围内进行，由几种可在不同pH值范围内发挥作用的有机酸复配在一起拓宽了抑菌和调菌区系，使得添加量更少，作用效果更显著，各组分能相互起到协同增效的作用。因此饲料中添加甲酸+乙酸+丁二酸的复合酸不仅可以有效的酸化日粮，保证消化酶在正常pH值环境下发挥酶活性，促进机体对营养物质的吸收，还可以优化罗非鱼肠道菌群结构，减弱有害微生物对宿主的影响。试验2组中添加的柠檬酸是罗非鱼体内三羧酸循环中由乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合而成的第一个中间产物，是机体容易利用的能源，可被直接吸收参与体内能量、酸碱平衡等一系列重要代谢过程，从而提高罗非鱼对日粮中养分物质的消化吸收。

动物机体的总抗氧化能力T-AOC与机体的健康程度存在密切关系，机体的抗氧化系统包含有酶促与非酶促两个体系，其中T-SOD 属于酶促体系[6，15-16]。在本试验中，各组间血清和肝脏的T-SOD 活性都没有显著性差异，但是，酸化剂试验2 组中的血清TAOC 显著上升，而T-AOC 作为评价机体抗氧化性能的总体指标，其大小可以反映机体清除氧自由基的能力，其提高表明改善了鱼的抗氧化系统功能，提高了鱼机体的抗氧化性能[17-18]，这说明作为高效抗氧化剂的柠檬酸在富马酸的协同作用下更好地清除鱼体内过多活性氧自由基分子，有效清除超氧阴离子（O2-·）抑制和切断脂质过氧化反应[19]。更好地维持机体抗氧化系统平衡[20]，柠檬酸形成能量的途径比葡萄糖还短，在应激状态下可用于ATP 的紧急合成，提高机体的非特异性抵抗力，增强抗应激能力。而富马酸的添加则具有协同作用，可以有效增强柠檬酸的抗氧化作用[21]。

ACP与AKP是机体两种重要的功能调节酶，与机体的生长密切相关[22]。其血清ACP 和AKP 活力受摄食状况、生长阶段、环境等因素影响而发生变化[3]。ACP 是在酸性条件下催化磷酸单酯的水解酶[23-24]，AKP 广泛存在于各种动物体内，能催化水解磷酸单酯，直接参与磷酸基团的转移，是动物体内重要的解毒体系[11]；AKP 也是一种肠上皮刷状缘膜酶，与鱼类的消化间接相关[25-26]，一般认为，鱼体内AKP 参与了鱼肠上皮细胞的吸收与转运，协助肠上皮细胞吸收葡萄糖、脂类、钙和无机磷[27]。本试验结果显示，不同配伍的酸化剂对罗非鱼血清ACP 和AKP 的影响差异显著，柠檬酸+富马酸组的血清ACP 和AKP 与富马酸+丙酸组相比显著提高，这与之前试验结果一致。有研究表明，水生动物中添加柠檬酸可以有效的提高干物质消化率，促进消化酶发育。在奥尼罗非鱼饲料中添加10 g/kg柠檬酸使胃蛋白酶活性提高29.6%，肝胰脏和肠道淀粉酶活性分别提高30.7%和29.4%（P＜0.01）。而柠檬酸可以改善酶活性可能与其降低胃肠道pH 值并作为中间物质直接参与能量代谢有关，其具体作用机制仍需进一步研究。

4 结论

单一酸化剂具有功能单一、添加量大、刺激性强等缺点，而复合酸化剂可以有效克服上述缺点。进行复合酸化剂配伍时，除应根据日粮系酸力来确定满足维持机体消化道酸度所需的酸化剂添加量、实现日粮酸化与电解质平衡[28-29]，还应根据不同酸的解离度以及作用机理进行合理配比，从而充分发挥酸化剂生理功能[30]。本试验结论表明，甲酸+乙酸+丁二酸以及柠檬酸+富马酸的复合酸化剂配伍实现了不同酸化剂之间的协同合作，有效改善罗非鱼生长性能，提高机体抗氧化能力。