饲料中添加虾青素对大鳞副泥鳅生长和体色的影响

■姚金明 陈秀梅 刘明哲 牛小天 单晓枫 王桂芹

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

虾青素又名虾黄素、虾黄质、龙虾壳色素，是一种端基为酮基的类胡萝卜素，不仅具有抗氧化、增强免疫力、提高繁殖力等生理功能，目前作为着色剂在水产养殖上被广泛应用[1-2]。这是因为动物体内缺乏相关酶系自身不能合成虾青素（海产动物也不例外)[3]。但是，研究发现一些水产动物体内均含有丰富的虾青素，其主要来源是通过摄食含虾青素的藻类或其他微生物，从而在体内积聚虾青素。目前在人工集约化养殖条件下，水产动物不能从外界获取足够的虾青素，导致体色异常普遍变浅[4]。而虾青素进入动物体后可以不经修饰或转化而直接贮存在组织中，并可与肌红蛋白非特异性结合。因此，与其他类胡萝卜素相比虾青素具有较好的着色效果[5]。已有的研究表明，在家禽饲料中添加虾青素不仅可以提高生长性能、降低料肉比，更可富集在禽蛋、禽肉中，改善其色泽和风味，进而增加其营养价值和保健功能[6-8]。在水产动物方面，近年来国内外的学者已经在七彩神仙鱼(Symphy-sodon aequifasciata)[9]、血鹦鹉(Cichlasoma var.)[10]、锦鲤(Cyprinus carpio)[11]及虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[12]等物种上开展研究，这些研究结果均表明在饲料中外源添加虾青素均有促进鱼类的生长、改善体色的效用。

大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）隶属于鲤形目（Cypriniformes）、鳅科（Cobitidae）、花鳅亚科（Co-bitidae），属于副泥鳅属（Paramisgurnus），是一种常见的小型淡水经济鱼类，在我国自南至北均有分布[13]。作为近几年东亚地区养殖需求非要高的水产养殖品种之一，市场潜力巨大。但受养殖密度过大和高效配合饲料匮乏的限制，大鳞副泥鳅生长速度缓慢、体色异常，严重地降低了产品品质和经济效益。而且关于虾青素在大鳞副泥鳅养殖中的应用，目前在生产上几乎是空白。因此，本试验通过外源添加虾青素初步探讨虾青素对大鳞副泥鳅生长及体色的影响，以期为虾青素作为增色剂的开发利用提供相关理论依据，为虾青素在大鳞副泥鳅健康养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料的制备

虾青素购于西安泽邦生物科技有限公司（提取于雨生红球藻，浓度为2%），在基础饲料中添加不同水平（0、50、100、150、200 mg/kg）虾青素配成五种配合饲料。饲料原料粉碎后经0.246 mm（60 目）筛，按饲料配方称重，并加工成直径为1.2 mm的颗粒状饲料，于室外晾晒，晾干后放置于-20 ℃冰箱中保存备用。饲料配方及营养水平见表1。

1.2 试验鱼及饲养管理

大鳞副泥鳅幼鱼购买于吉林省2814 养殖场，饲养试验在室内单循环养殖系统中进行，在试验前饲养于水族箱中15 d。饱食投喂对照组饲料使其适应试验饲养环境和饲料，然后挑选身体健康、体型及规格一致，体重为(3.01±0.10) g的大鳞副泥鳅450尾，随机分成5 组，每组3 个重复，每个重复30 尾。水族箱水温设定23～25 ℃，溶解氧大于5 mg/l，pH 值7.1±0.1。每日饱食投喂两次（9：00、16：00），1 h 后检查水族箱内残饵情况，用虹吸法吸出沉积残饵，并根据残饵量调整投喂量。饲养试验为期8周。

1.3 样品的收集与测定

1.3.1 样品的收集

表1 饲料配方及营养水平（风干基础）

8 周养殖结束后，禁食24 h，称量体重后，冰上解剖取头、鳍、肝胰脏、肠道、皮肤及肌肉，-80 ℃冰箱保存待测。

1.3.2 生长指标测定

平均增重率(WG，%)=(Wt-W0)/W0×100

特定生长率(SGR，%/d)=(ln Wt-ln W0)/t×100

式中：Wt、W0——分别为初始和终末鱼体重（g）；

t——试验时间（d）。

1.3.3 类胡萝卜素含量的测定

将大鳞副泥鳅头、鳍、皮肤和肌肉组织放在吸水纸上，准确称取质量后置于10 ml 离心管中（精确到0.01 g）。向离心管中各加3 ml丙酮，放入匀质器中匀浆6 s间隔1 min 匀浆3次后取出；用锡纸包裹密封于4 ℃保存24 h后，以8 000 r/min离心10 min。离心后分别将各样品在具塞试管中稀释定容到6 ml，将所得的组织色素萃取液分别置于1 cm 比色皿中，以丙酮为空白对照管（加盖防止丙酮挥发），在紫外-可见分光光度计380～620 nm波长范围内进行扫描，找出最大吸收峰处的波长，在该波长（448 nm）下测定各组提取液的吸光值。类胡萝卜素含量的计算公式如下所示：

类胡萝卜素含量（F，mg/kg）=（A×K×V）/（E×G）

式中：A——吸光值；

K——常数（104）；

V——提取液体积（ml）；

E——吸光系数（2 500）；

G——样品湿重（g）。

1.3.4 酪氨酸酶（tyrosinase，Tyr）的测定

将大鳞副泥鳅肝脏、肠道、皮肤和肌肉组织解冻、剪碎并称其重量（精准到0.01 g），加入4 ℃的生理盐水稀释10倍，匀浆5 min，4 ℃离心10 min(5 000 r/min)，取上清液，置于离心管中，4 ℃保存，并在24 h 内测定完毕。

Tyr 的含量采用ELISA 检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）测定，试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验。依次往预先包被Tyr抗体的包被微孔中加入样品、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育、清洗、底物TMB 显色。颜色的深浅和样品中的Tyr 呈正相关。用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度（OD值），并计算样品浓度。

1.4 统计与分析

数据采用SPSS（20.0）软件对数据进行方差分析，若方差分析显著，进一步进行Duncan's 法多重比较，分析组间差异显著性，显著水平设定P＜0.05，试验数据采用“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 饲料虾青素添加水平对大鳞副泥鳅生长的影响(见表2)

表2 饲料中虾青素水平对大鳞副泥鳅生长的影响

由表2 可见，虾青素对大鳞副泥鳅生长有影响。大鳞副泥鳅的平均增重率和特定生长率随虾青素的添加水平提高而呈现上升的趋势，当虾青素的添加水平为50～200 mg/kg 时显著高于对照组（P＜0.05），且在虾青素的添加量为100 mg/kg时达最高水平（P＜0.05）。

2.2 饲料虾青素添加水平对大鳞副泥鳅各组织类胡萝卜素含量的影响(见图1)

由图1可见，虾青素对大鳞副泥鳅各组织总类胡萝卜素含量有影响。大鳞副泥鳅头、鳍、皮肤和肌肉类胡萝卜素含量随虾青素的添加水平提高呈现上升的趋势，当虾青素的添加水平为100～200 mg/kg时，均显著高于对照组（P＜0.05），其中当虾青素的添加水平为150 mg/kg和200 mg/kg时达到最高水平（P＜0.05）。

2.3 饲料虾青素添加水平对大鳞副泥鳅各组织Tyr含量的影响（见图2）

由图2 可见，虾青素对大鳞副泥鳅各组织Tyr 含量有影响。大鳞副泥鳅的各组织Tyr含量随虾青素的添加水平提高呈现下降的趋势：当虾青素的添加水平为150～200 mg/kg 时，肝脏Tyr 含量显著低于对照组（P＜0.05）；当虾青素的添加水平为50～200 mg/kg 时，肌肉和皮肤Tyr 含量显著低于对照组（P＜0.05）；但肠道中各组的Tyr含量差异不显著。

3 讨论

3.1 饲料虾青素添加水平对大鳞副泥鳅生长的影响

作为饲料添加剂，虾青素具有明显的促生长作用，适宜添加后可使饲喂水产动物达到最佳生长状态。在本试验条件下，随着虾青素添加水平的提高，大鳞副泥鳅的平均增重率和特定生长率均呈现上升的趋势。当虾青素的添加量为50～200 mg/kg时，大鳞副泥鳅的平均增重率和特定生长率显著高于对照组。类似的研究结果有很多，黄璞祎等[9]对七彩神仙鱼的研究结果表明，以生长需要和养殖成本为评价指标，虾青素适宜的添加水平为50 mg/kg。孙刘娟等[10]对血鹦鹉的研究结果表明，2‰和3‰虾青素添加量可获得较好的生长效果。崔培等[11]对红白锦鲤的研究结果则表明饲料中虾青素添加量为700 mg/kg 时，体质量增长率、蛋白质效率显著高于对照组。此外，其他水产动物如斑节对虾（Penaeus monodon）[14]、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）[15]、南美白对虾幼虾（Penaeus vannamei Boone）[16]以及仿刺参幼参（Apos-tichopus japonicus）[17]上的研究结果同样证明虾青素对水产动物有一定的促生长作用。以上研究均验证了虾青素的促生长作用，但Harpaz等[18]发现饲料中添加虾青素不能显著提高红螯螯虾(Chrtax quadricarina-tus)的生长率及成活率。究其原因，这可能是因代谢机制的差异，虾青素添加量没有达到其所需量。这也表明虾青素促生长作用可能存在浓度依赖性，而且虾青素促生长作用的具体调控机制仍需深入研究。

图1 饲料虾青素添加水平对大鳞副泥鳅各组织类胡萝卜素含量的影响

3.2 饲料虾青素添加水平对大鳞副泥鳅体色的影响

体色是鱼类一种较为独特的表型性状，在人工养殖过程中，某些养殖品种虾青素摄食量达不到需求，体内积累不够，导致其体色不够红润，影响商品价值。因此，许多研究者以虾青素作为添加剂，来改善水产动物体色。牟文燕等[19]和张晓红等[20]研究结果均证明血鹦鹉在摄食添加虾青素的饲料后，其体内色素沉积量明显增加，增色效果显著，并得出虾青素适宜添加量为500 mg/kg。类似地，李小兵等[21]在对金曼龙鱼（Trichogaster microlepis）的研究结果表明：饲料中添加虾青素后，其色素主要沉积在鱼鳍、鱼皮和鱼鳞表面，且添加量为100 mg/kg时，其着色效果最佳。同样，本试验研究结果表明大鳞副泥鳅的各组织类胡萝卜素含量随虾青素的添加水平提高呈现上升的趋势，当虾青素的添加水平为100～200 mg/kg时显著高于对照组，且当虾青素的添加水平为150 mg/kg和200 mg/kg时达到最高水平。这说明体色的改善存在浓度依赖效果，在红罗非鱼（Oreochromis mossambicus）体色方面的研究亦证明了这一点：虾青素添加量为400 mg/kg 时红罗非鱼皮肤、鳍、肌肉、眼球和腮中类胡萝卜素含量较对照组显著提高，体色明显改善；800 mg/kg 时，粉白红罗非鱼和黑斑红罗非鱼腮部类胡萝卜素沉积量较对照组显著提高[22]。

深入分析，鱼类之所以呈现不同的体色，是因为鱼体内存在着各种不同的色素细胞（黑色素细胞、黄色素细胞、红色素细胞、虹彩细胞、白色素细胞等），随着色素细胞内色素颗粒的移动导致体色的变化（不同的阴暗和着色情况），同时受神经及内分泌系统（激素）的调控[23]。目前在众多色素细胞中黑色素细胞是当前国内外体色研究最为广泛而深入的，黑色素细胞主要分泌真黑素和褐黑色素[24]，其中酪氨酸酶（Tyr）对真黑色素的生成发挥关键性作用。有研究报道，通常鱼的背部表面Tyr 的含量和活性较腹面高，体色也较深[25]。本试验条件下，大鳞副泥鳅的肝、肌肉和皮肤组织的Tyr含量随虾青素的添加水平提高呈现下降的趋势。这表明饲料中添加虾青素可通过减少Tyr 含量，进而减少黑色素的生成，提亮鱼体体色。但是，也有一些研究结果表明体色淡的鱼类体内酪氨酸酶也具有较高活性（但黑素细胞中没有黑色素），分析酪氨酸酶可能存在多种形式，部分处于抑制状态[26]。但关于虾青素如何具体调控大鳞副泥鳅体色的机制仍不清楚。总之，丰富多彩的鱼类体色是长期自然选择的结果，涉及遗传学、进化生物学和系统发育学。因此，要想探明鱼体体色变异还需借用现代分子生物学技术，进一步明确鱼类体色变异的分子机制，在此基础上营养调控才能发挥最大的功用。

图2 饲料虾青素添加水平对大鳞副泥鳅各组织Tyr含量的影响

4 结论

本试验条件下，在大鳞副泥鳅饲料中添加100～200 mg/kg虾青素可显著提高大鳞副泥鳅各组织类胡萝卜素含量，降低Tyr含量，进而有效改善大鳞副泥鳅体色。