昆明系小鼠肠炎沙门菌感染的诊治

牟泽华 , 孔垂民 , 刘文华 , 刘焕奇

(青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109)

实验动物在生物科学的研究发展中发挥着重要的作用，确保选用的实验动物健康，是动物实验成功的首要前提。小鼠作为实验动物的重要组成部分，广泛的应用于生命科学的各个领域[1]。昆明系小鼠有着抗病力和适应性强，繁殖率存活率高的特点，是我国生产量、使用量最大的远交群小鼠。

沙门菌为革兰阴性杆菌，种类繁多，分布广泛，有些为动物疾病病原，有些为人兽共患病病原，是世界范围内最主要的食源性病原之一，侵害动物后发生败血症、胃肠炎、局部炎症[2]。肠炎沙门菌感染以腹泻和流产为特征。现如今对于沙门菌的检测技术较多，如免疫分析技术、分子生物学技术、 纳米技术等[3]，这些技术提高了检测的效率和准确率，为沙门菌的防治工作提供了保障。

2018年6月，某实验动物养殖场饲养的昆明系小鼠出现大范围死亡现象，小鼠腹泻消瘦、食欲减退，体重不达标，雌鼠繁殖能力下降，流产，产死胎。通过实验室检测，确诊该养殖场的小鼠感染了沙门菌，具体诊治过程如下。

1 材料与方法

1.1 动物来源及主要试剂 某实验动物养殖场送检健康的昆明系小鼠10只。PCR试剂，购自TaKaRa公司。

1.2 临床诊断 送检的小鼠禁食24 h后，脱颈处死，70%酒精浸泡消毒后对小鼠进行剖检观察。

1.3 细菌的分离与鉴定

1.3.1 细菌的分离 无菌采集小鼠的肝脏，脾脏，子宫干酪样内容物，分别接种于普通培养基及S.S.培养基中。37 ℃培养24 h，观察菌落形态，然后利用S.S.培养基对可疑菌落进行3代纯化。

1.3.2 细菌的镜检 挑取纯化的单菌落，进行革兰染色，利用光学显微镜观察细菌形态。

1.3.3 细菌的PCR鉴定 挑取分离纯化的单菌落，利用煮沸法提取DNA作为模板，参照Oliveira，S.D等[4]针对沙门菌invA基因的特异性引物以及16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，具体反应条件见表1。为了从种的水平鉴定沙门菌，将扩增的与预期片段大小一致的16S rRNA基因片段的PCR产物送往上海派森诺生物股份有限公司进行测序。测序结果与NCBI核酸数据库进行BLAST比对。

表1 PCR反应引物序列和反应条件

1.4 动物回归试验 随机将健康的昆明系小鼠分为2组，每组5只。挑取纯化的单菌落，LB摇菌过夜，生理盐水调整菌液浓度1×109CFU/mL，试验组小鼠腹腔注射0.2 mL菌液，对照组小鼠腹腔注射0.2 mL无菌生理盐水。观察小鼠临床症状。

1.5 纸片扩散法药敏试验 对不同组织分离纯化的菌株经LB摇菌过夜，菌液进行常规的纸片扩散法药敏试验。

2 结果

2.1 小鼠的病理变化 剖检患病小鼠可见小鼠肝脏肿大，边缘有白色区域性坏死灶、可见出血点。脾脏显著出血，充血，显著肿大，大小为正常小鼠脾脏的2～3倍，质脆，呈蓝紫色(见中插彩版图1)。子宫壁增厚，粗糙，可见干酪样内容物(见中插彩版图2)。

图1 患病小鼠肝、脾肿大

图2 子宫干酪样渗出物

2.2 细菌的分离与镜检 在患病小鼠的肝脏、脾脏、子宫内容物均分离到细菌，细菌在普通培养基上生长良好，为中等大小无色半透明菌落，在S.S.培养基上菌落呈黑色。革兰染色镜检，菌体显示为两端钝圆的中等大小的革兰阴性杆菌。

2.3 细菌的PCR测定及分析比对结果 以沙门菌的特异性引物进行的PCR扩增获得了预期284 bp的目的条带，结合培养特性确认该分离株为沙门菌。16S rRNA基因通用引物的PCR扩增获得了预期900 bp的目的条带。PCR电泳结果如图3所示。

图3 PCR检测结果
M：DL-2 000 ； 1、8：肝脏分离株 ； 2、9：脾脏分离株 ；3、10：子宫内容物分离株 ； 4、7：阳性对照 ； 5、6：阴性对照

将测序获得的16S rRNA基因序列在GenBank进行BLAST比对，结果表明不同组织中分离的沙门菌扩增得到的基因序列与肠炎沙门菌的同源性均达100%，所以判定分离的沙门菌为肠炎沙门菌。

2.4 动物回归试验 对健康的昆明系小鼠攻毒后，试验组小鼠6 h后就出现精神沉郁症状，8 h后出现死亡，12 h后攻毒小鼠全部死亡。对照组小鼠无任何症状。剖检试验组小鼠，可见肝脾与对照组相比明显肿大，并从死亡小鼠肝脾中分离到了沙门菌。

2.5 药敏试验 分离的沙门菌进行纸片扩散法药敏试验，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)动物源细菌药敏试验标准，判断菌株的敏感性，结果见表2。

由表2可知，不同组织中分离菌株的药敏试验结果基本相同，普遍对头孢类药物、盐酸左氧氟沙星、磷霉素钙显示高度敏感；对氨基糖苷类药物、氟苯尼考中度敏感；对林可霉素、硫酸黏霉素、盐酸多西环素等耐药。

2.6 治疗效果 根据药敏试验结果及药物配伍原则，选择头孢他啶与盐酸左氧氟沙星进行联合用药。用药3 d后全群不再有死亡，用药5 d病情得到有效控制。

3 讨论

各种年龄的动物均可感染肠炎沙门菌，但该菌最常侵害幼年和青年动物，使其发生败血症、腹泻及产生局部炎症及流产症状[2]。送检的小鼠通过剖检发现，小鼠肝脾显著肿胀、出血，子宫内呈明显的干酪样炎症，有流产不孕现象。这些表现符合肠炎沙门菌感染的临床症状。沙门菌多经过消化道感染健康动物，但送检小鼠，子宫炎症非常明显，说明肠炎沙门菌除引起消化道症状外，也可引起生殖道感染。

表2 分离菌株的药敏试验

S表示高度敏感 ； I表示中度敏感 ； R表示耐药

通过动物回归试验发现小鼠在攻毒后6 h就出现临床症状，8 h小鼠出现死亡，说明该菌具有极强的致病性，由于小鼠死亡迅速，小鼠主要的病理变化为肝脾充血、肿胀，子宫及胃肠道症状不明显。药敏试验表明，本试验分离到的菌株对革兰阴性菌有作用的抗生素耐药性较差，基本表现为中等敏感或敏感，说明抗生素治疗效果会比较显著。

传统的生化试验及血清学鉴定方法用于细菌的鉴别诊断步骤繁琐，耗时较长，不利于疾病的快速诊断，分子生物学以其快速敏感准确的特点目前被广泛用于疾病的检测[5]。本试验首先通过菌落及菌体形态初步怀疑为沙门菌感染，然后利用沙门菌的特异性引物及16S rRNA基因的通用引物对提取的DNA进行扩增，双管齐下，确保了诊断的正确率。

患病鼠及带菌鼠是主要传染源，环境污秽、潮湿、鼠房拥挤、营养不良等是诱发本病的主要因素[6]。通过询问养殖人员发现，换水及换垫料的频率低，饲养室内外、垫料等消毒不彻底，养殖密度严重超标，这些不规范的养殖模式是疾病发生的主要诱因，同时患病鼠间通过交配进一步扩大了感染范围。

虽然通过敏感药物治疗控制了病情，由于实验动物的特殊性，药物治疗并非首选，养殖过程中，加强对病原感染的防范才是关键。对于沙门菌的防控要做到以下几点：一是引进种鼠要进行隔离检疫，健康方可混群和使用；二是坚持卫生消毒制度，定期对小鼠房舍及饲养用具进行消毒；三是垫料严格消毒，保证垫料干燥，房舍通风，并严防野鼠出入；四是保持适宜的饲养密度，避免密度过大导致环境氨氮浓度超标而诱发呼吸道疾病；五是保证饲养人员健康，发现疫情及时汇报，对淘汰患病小鼠采取无害化处理。如果疫情不能完全得到控制，建议全群淘汰，全面消毒后，重新引种[7]。