呼伦贝尔地区宠物犬子宫内膜炎致病菌的分离鉴定与耐药性分析

王显峰 , 白萨日娜

(扎兰屯职业学院 ， 内蒙古 扎兰屯 162650)

研究表明，宠物犬相关疾病逐渐增多，如犬瘟热、细小病毒、寄生虫虫病、腹泻、子宫内膜炎等[1]。因此，在宠物犬养殖过程中，应该注意相关疾病的预防，定期检测、免疫，同时还要注意环境卫生与消毒。临床中母犬生殖系统疾病逐渐增多，尤其是子宫内膜炎发生频率逐渐增多，成为母犬生殖系统疾病中重要疾病之一，宠物犬的子宫内膜炎大多数由于产后护理不当或者外界细菌感染后引起的子宫内膜炎症病变，宠物犬子宫感染细菌后可以引起子宫的严重损伤，同时可以继发其他的器官感染[2-3]。临床中许多病原菌均可以引起动物子宫内膜炎，严重者可以引起死胎、流产[4]。临床中关于奶牛子宫内膜炎的病原菌的报道较多，致宠物犬子宫内膜炎病原菌报道的较少。本试验从宠物医院采集患子宫内膜炎犬的内容物、阴道分泌物等病料组织240份，进行病原菌分离鉴定、致病性检测及耐药性分析，为宠物犬子宫内膜炎治疗用药提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 采集呼伦贝尔地区宠物医院患子宫内膜炎宠物犬的内容物、阴道分泌物等病料组织240份。

1.2 试剂与仪器 增菌培养基、哥伦比亚培养基、7%绵羊血培养基、大肠杆菌显色鉴别培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基，均购自成都康迪生物科技有限公司；大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌生化鉴定试剂盒、药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司；革兰阴性、阳性菌基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；梯度PCR仪、离心机、隔水式恒温培养箱等仪器由本实验室提供。

1.3 实验动物 体重(25±2.2)g健康昆明系雌性小鼠290只，购自呼伦贝尔市实验动物中心。

1.4 分离与鉴定 将采集的患子宫内膜炎宠物犬的子宫内容物、阴道分泌物等病料组织进行处理，接种到增菌液中，37 ℃震荡培养12-18 h，取扩增菌液中病原菌分别接种于哥伦比亚培养基、7%绵羊血培养基、大肠杆菌显色鉴别培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基进行鉴别培养，挑取鉴别培养基上单个菌落接种于营养肉汤中进行纯化培养，取纯化培养的分离菌株进行染色镜检和生化试验。

1.5 细菌生化试验 按照说明书，调整纯化培养的分离菌株菌液浓度，分别接种于大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌生化鉴定试纸条中培养，用自动细菌生化鉴定系统鉴定。

1.6 细菌的PCR鉴定 参考文献[5-6]，设计大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌保守区基因序列特异引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用革兰阴性、阳性菌基因组 DNA 提取试剂盒提取分离株的基因组DNA，用特异性引物进行PCR鉴定，其PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果与GenBank数据库中登录参考株的基因序列进行同源性比对。

1.7 细菌致病性试验 参考文献[5]，调整分离菌株的菌液浓度为1.0×108CFU/mL，将290只小鼠随机分为145组，每组2只，试验组为1～144组，每株菌株为1个试验组，阴道注射2只小鼠，剂量为0.25 mL，145组为对照组，给予等量的无菌PBS，攻毒后观察6 d，记录发病死亡情况并进行细菌鉴定。

表1 引物序列

1.8 药敏试验 参照用美国临床检验标准委员会(NCCLS)2018年推荐的标准K-B纸片法进行，按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)的标准判断耐药(R)、敏感(S)或中介(I)进行结果判断，分析耐药性。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定 疑似大肠杆菌的分离菌株在大肠杆菌显色鉴别培养基长出圆形的、边缘整齐的绿色的菌落，镜检呈两端钝圆杆状阴性菌；疑似链球菌分离菌株在7%绵羊血培养基、哥伦比亚培养基上长出了圆形的、大小一致的、略带黏液样菌落呈现β溶血，镜检呈单个散在或多个球形阳性菌；疑似金黄色葡萄球菌在甘露醇氯化钠琼脂培养基上长出圆形的、边缘整齐的浅黄色菌落，在7%绵羊血培养基呈现β溶血，镜检呈单个短链和成堆的葡萄串状排列的阳性球菌。

2.2 细菌生化鉴定结果 55株菌株的V-P试验呈阴性、吲哚和甲基红反应为阳性，能分解甘露醇、葡萄糖、麦芽糖产酸产气，被鉴定为大肠杆菌； 48株菌株的靛基质试验阴性、V-P试验和过氧化氢酶试验阳性，分解葡萄糖、半乳糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖，且产酸不产气，被鉴定为金黄黄色葡萄球菌；40株菌株的V-P试验为阳性，发酵乳糖、七叶苷、水杨酸、山梨醇；不发酵核糖、甘露醇、菊糖及棉籽糖，被鉴定为链球菌。

2.3 细菌PCR鉴定 PCR鉴定结果显示，55株分离株扩增出大肠杆菌目的基因片段231 bp，48株分离菌株扩增出金黄黄色葡萄球菌目的基因片段418 bp，40株分离菌株扩增出链球菌目的基因片段874 bp。测序结果：3种病原菌的测序结果与GenBank库中登录的分离的大肠杆菌、金黄黄色葡萄球、链球菌参考株基因序列同源性97.9%～99.9%之间。从而证明了从采集的病料组织240份中分离得到了56株大肠杆菌、48株致病性试验结果金黄色葡萄球菌、40株链球菌。

2.4 致病性试验结果 试验组小鼠在攻毒后的3-4 d出现精神沉郁、采食量减少、外阴部出现肿胀、流出脓性黏液，个别小鼠出现死亡。从发病死亡的的小鼠体内分离到大肠杆菌、金黄黄色葡萄球菌、链球菌。对照组小鼠无明显的症状。根据试验结果统计，42株大肠杆菌、32株金黄色葡萄球菌、30株链球菌对小鼠具有致病性。

2.5 耐药性分析结果 试验结果见表2， 42株致病性大肠杆菌对强力霉素、庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶、环丙沙星、氟苯尼考、大观霉素、青霉素G、阿莫西林、氨苄西林9种药物的耐药率在45.2%～100%之间，对林可霉素、恩诺沙星、头孢噻呋、头孢曲松4种药物的耐药率在11.9%～28.6%之间；32株致病性金黄色葡萄球菌对氟苯尼考、大观霉素、强力霉素、庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶、环丙沙星、青霉素G、氨苄西林、阿莫西林9种药物的耐药率在42.9%～100%之间；林可霉素、恩诺沙星、头孢噻呋、头孢曲松耐药率在12.5%～25.0%；30株致病性链球菌对青霉素G、阿莫西林、氨苄西林、环丙沙星、氟苯尼考、大观霉素、强力霉素、庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶9种药物耐药率在40.0%～96.7%之间，对头孢噻呋、头孢曲松、恩诺沙星、林可霉素4种药物耐药率在13.3%～33.3%之间。

表2 耐药性分析结果

3 讨论

临床中许多病原菌均可以引起动物子宫内膜炎，严重者可以引死胎、流产，引起宠物犬子宫内膜炎的病原菌主要包含大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等[6-7]。本试验从呼伦贝尔地区宠物医院采集患子宫内膜炎宠物犬的子宫内容物、阴道分泌物等病料组织240份，通过采用细菌学鉴定和PCR法分离得到了56株大肠杆菌、48株金黄色葡萄球菌、40株链球菌，通过人工感染动物试验对分离的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌验证其致病性，结果显示，42株大肠杆菌、32株金黄色葡萄球菌、30株链球菌对小鼠具有致病性，说明致宠物犬子宫内膜炎病原菌以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌为主。刘明达等[3]报道了从石河子市部分宠物医院采集的48例患病犬的阴道分泌物和子宫内容物中分离出58株致病菌，其中主要包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、链球菌等。与本试验结果存在差异性可能与地区有关。国内关于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及链球菌引起奶牛子宫内膜炎报道较多，关于宠物犬报道较少。因此，本试验对分离的致宠物犬子宫内膜炎大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及链球菌进行耐药性分析。

在小动物临床治疗中为了控制细菌性感染，抗菌药物不合理使用，很容易导致很强的耐药性，由于宠物犬与人接触，其携带的耐药菌有可能通过亲密接触在人类中传播[8-9]。本试验药敏试验结果表明，42株大肠杆菌对强力霉素、庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶等9种药物的耐药率在45.2%～100%之间，32株金黄色葡萄球菌对氟苯尼考、大观霉素、强力霉素等9种药物的耐药率在42.9%～100%之间，30株致病性链球菌对青霉素G、阿莫西林、氨苄西林等9种药物耐药率在40.0%～96.7%之间。说明在临床中对宠物犬的子宫内膜炎的治疗时，不合理的使用抗菌药物，造成宠物犬源致病菌产生很强的耐药性。因此，在临床治疗相关疾病应该引起重视。