仔猪腹泻大肠埃希菌的分离鉴定及耐药性分析

刘丽娟 ， 马光强 ， 王 伟 ， 王开功 ， 周碧君

(1.贵州省都匀市农业农村局 ， 贵州 都匀 558000 ；2.黔南民族职业技术学院 ， 贵州 都匀 558000 ； 3.贵州大学动物科学学院 ， 贵州 贵阳 550025)

仔猪腹泻是全球养猪业面临的猪群常发疾病之一，具有高发病率、高死亡率等特点，严重影响了养猪业的发展[1]。引发仔猪腹泻的病原有很多，包括大肠埃希菌、魏氏梭菌、猪痢疾密螺旋体、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪球虫、猪蛔虫等[2]。其中大肠埃希菌一直被认为是引发仔猪腹泻的重要病原之一，可引发仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病[3]。由于大肠埃希菌血清型众多，各地区的流行菌株不一，导致疫苗预防效果并不理想，养殖户为降低腹泻发病率，常在生产活动中大量添加抗生素[4]。为此大肠埃希菌耐药菌株不断增多，耐药机制也日趋复杂，致使细菌耐药性问题日趋严重，防治难度越来越大。如何有效防治猪大肠埃希菌病成为规模化养猪场亟需解决的难题。为了解贵州地区仔猪腹泻大肠埃希菌病流行情况和耐药的情况，本试验对2016年4月-7月间采集于贵州地区规模化养猪场的128份腹泻仔猪肠道样本进行了细菌的分离鉴定、致病力试验及耐药性分析，旨在为猪大肠埃希菌病的防控提供参考理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2016年4-7月间采集贵州省4个地(州、市)7个规模化养殖场出现腹泻症状的仔猪肠内容物128份，4 ℃保存送至贵州大学动物疫病研究室立即做细菌分离培养。

1.2 主要试剂 麦康凯琼脂、营养肉汤培养基、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管、药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL-2 000 DNA Marker、细菌基因组DNA提取试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；其他试剂均为国产分析纯。大肠埃希菌质控菌株ATCC25922由贵州省动物疫病研究室保存。

1.3 引物 根据大肠埃希菌的保守基因序列特征，参考马光强[5]2016年报道的大肠埃希菌特异性鉴定引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 通用鉴定基因PCR引物序列

1.4 实验动物 BALB/c小鼠，购自贵州医科大学实验动物中心。

1.5 细菌分离培养及生化鉴定 取腹泻仔猪肠道样品接种于营养肉汤培养基，37 ℃过夜培养，将增菌液用接种环在麦康凯琼脂培养基上进行“Z”字型划线，37 ℃培养18-24 h 后，挑取单个菌落进行纯培养，观察菌落形态、革兰染色镜检，并用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管对纯培养物进行生化鉴定。

1.6 PCR鉴定 以细菌基因组DNA提取试剂盒所提取分离菌基因组总DNA为模板，应用表1中引物进行目的基因扩增。PCR反应体系：2×TaqPCR Master Mix 10.0 μL、基因组DNA模板1.0 μL、上下游引物各1.0 μL(10 μL mol/L)、加灭菌双蒸水补足至20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.7 动物致病性试验 将鉴定的大肠埃希菌菌液按0.2 mL/只(5.9×108CFU/mL)剂量，腹腔注射小鼠，空白对照组小鼠，腹腔注射0.2 mL灭菌生理盐水。观察并剖检发病和死亡的小鼠，统计致死率，组织采样后回接至麦康凯琼脂，取优势细菌染色观察并与初始培养细菌对比。

1.8 药物敏感性试验 按照细菌药敏试纸使用说明书及美国临床和实验室标准协会(CLSI)2012年制定的药敏纸片琼脂扩散法标准(K-B 法)进行，将分离菌接种在 LB 液体培养基中增菌培养，分别均匀涂布于普通营养琼脂培养基，选取4大类抗生素共 12 种常见药敏纸片贴于培养基上，置 37 ℃培养 24 h，测量抑菌圈直径，按该标准进行结果判定。以大肠埃希菌 ATCC 25922 作为质控菌株。

2 结果

2.1 细菌分离培养及生化鉴定 128份样本有78份在麦康凯培养基上均长出边缘光滑整齐、湿润、粉红色扁圆形小菌落(中插彩版图1)；挑取典型菌落进行革兰染色、镜检，可见菌体为两端钝圆、红色、散在或者成双排列的革兰阴性杆菌(中插彩版图2)。生化鉴定结果显示，78株分离菌靛基质、甲基红、葡萄糖(产气) 、赖氨酸、鸟氨酸、棉子糖、山梨醇、木糖试验均呈阳性; 硫化氢、苯丙氨酸、葡萄糖酸盐、枸橼酸盐、尿素、侧金盏花醇、氨基酸对照试验均呈阴性; 半固体琼脂动力试验中仅有11株菌运动性呈阴性，其他均呈阳性。根据肠杆菌科细菌生化编码鉴定管第二代15e系列检索表，按照鉴定值查找编码结果显示，78株分离菌均为大肠埃希菌，分离率为61%(78/128)。

图1 分离菌在血平板上的生长情况

图2 分离菌革兰染色显微镜下观察结果(×1 000)

2.2 大肠埃希菌分子生物学方法鉴定 将用传统方法分离鉴定的78株大肠埃希菌按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，并以此为模板进行大肠埃希菌23S rRNA基因的PCR扩增，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。结果显示，78株大肠埃希菌均扩增出条带单一明亮的特异性条带。

通过生化和PCR鉴定方法分离鉴定到的大肠埃希菌进行符合率统计分析，结果显示，PCR鉴定方法与传统生化鉴定的结果一致，符合率达 100%(78/78)。

图3 大肠埃希菌PCR扩增结果
M：DL-2 000 DNA Marker ; 1:阳性对照 ；2～5：分离菌株 ； N：阴性对照

2.3 大肠埃希菌致病性试验 将分离鉴定的78株大肠埃希菌进行动物致病性试验，结果显示，试验组BALB/c小鼠注射菌液后均出现昏睡、厌食、被毛蓬乱、反应迟钝、精神萎靡等症状，少数可见拉稀症状；剖检可见腹腔充满黏性黄色渗出物，肝脏和肾脾肿大，肠道膨胀充气等病变。78株大肠埃希菌分离株中有56株均在48-72 h内致小鼠死亡，致死率71.79%(56/78)，而对照组小鼠无发病死亡。从死亡小鼠的肝脏和腹腔渗出液分离到培养特性、菌落形态均相同的分离菌，经PCR鉴定为大肠埃希氏菌。

2.4 致病性大肠埃希菌耐药表型分析 对分离鉴定的大肠埃希菌进行药敏试验，结果如表2所示，分离鉴定的78株大肠埃希菌对β-内酰胺类药物青霉素耐药率最高，为94.87%(74/78)，对磺胺类药物复方新诺明耐药率最低，为21.79%(17/78)，对其余抗菌药物均表现出不同程度的广泛耐药。

表2 78株致病大肠埃希菌分离株对12种抗菌药物敏感性试验

2.5 大肠埃希菌多重耐药性分析结果 本试验受试抗菌药物属于4类，3种为磺胺类，3种为氟喹诺酮类，3种β酰胺类，3种氨基糖苷类，多重耐药结果可知，78株大肠埃希菌分离株均为多重耐药菌株，其中2株耐3种药，耐药率为2.6%(2/78)；5株耐4种药，耐药率为6.4%(5/78)；4株耐5种药，耐药率为5.1%(4/78)；2株耐6种药，耐药率为2.6%(2/78)；11株耐7种药，耐药率为14.1%(11/78)；15株耐8种药，耐药率为19.2%(15/78)；17株耐9种药，耐药率为21.7%(17/78)；8株耐10种药，耐药率为10.2%(8/78)；14株耐11种药，耐药率为17.9%(14/78)。 所有分离菌株均为多重耐药菌株，多重耐药主要表现在7～11耐，占分离菌株的83.33%(65/78)。

3 讨论

近年来，随着我国养猪业的规模化发展，仔猪腹泻的发生与流行有明显增加的趋势。猪腹泻对养猪业危害巨大，仔猪最为严重。大肠埃希菌作为条件性致病菌，当外界环境改变、应激、饲料霉变等均易诱发本病[6]。大肠埃希菌引起的仔猪腹泻因发病日龄不同临床症状不同，仔猪黄痢主要发生在 1-3日龄内新生仔猪，仔猪白痢主要发生在10-30日龄哺乳仔猪，猪水肿病引起的腹泻主要发生在断奶后仔猪[7]。通常情况下，大肠埃希菌病的发病率和死亡率均较高，也是一类重要的人兽共患病。因此，对猪大肠埃希菌病应采取及时有效的防治措施。

本试验从贵州省4个地(州、市)7个规模化养殖场出现腹泻症状的128份仔猪肠内容物中共分离到78株猪源大肠埃希菌，分离率为60.94(78/128)；这一结果低于马长宾等(2016)[8]从新疆7个规模养猪场361份猪腹泻肠道样本中共分离到335株猪大肠埃希菌的分离率92.80%(335/361)，以及刘哲等(2017)[9]从河南省1个规模化养殖场1～7日龄腹泻仔猪69份肛拭子样品中共分离到69株猪大肠埃希菌的分离率100%(69/69)；高于李金鹏等(2018)[10]从河南省15家猪场腹泻病猪152份肠内容物中共分离到79猪猪源大肠埃希菌的分离率为51.97%(79/152)。这些差异可能是由于地域差异、动物健康程度不同或不同养猪场的用药情况不同所致。

近年来，用于防治仔猪大肠埃希菌病的药物常为抗生素，在应用抗生素的过程中不仅会杀灭病原菌，还会使得正常菌群失调，从而降低动物机体的抵抗力，且长期不合理使用更易产生耐药性[11]。本试验分离的78株大肠埃希菌对青霉素、氨苄西林、哌拉西林、庆大霉素、卡那霉素的耐药率较高，耐药率均超过80%；对其他试验抗生素的耐药率均在20%～80%之间。这与刘哲等(2017)[9]、杨宇(2017)[12]和吴学敏等(2017)[13]的报道基本一致，但与谷振等(2018)[14]、赵晓黎(2017)[15]和艾伟昌等(2017)[16]的报道存在明显差异。这种差异可能是因地域不同、动物种类不同、动物健康程度不同或不同养殖场的用药情况不同所致。从多重耐药情况来看，贵州省仔猪腹泻致病性大肠埃希菌多重耐药情况严重，3耐及3耐以上菌株高达100%，这一结果均高于艾伟昌等(2017)[16]、宁昆等(2016)[17]及蒲承君等(2017)[18]的研究。表明大肠埃希菌多重耐药受多种因素的影响。

仔猪腹泻病因复杂，往往是由多种因素共同作用的结果，如许多病毒性疫病、其他细菌性疫病、某些寄生虫病等[19]。虽然本次试验结果不足以说明分离获得的大肠埃希菌是引发仔猪腹泻的唯一因素，但根据药物敏感性试验结果调整临床用药，腹泻仔猪症状得到了缓解和控制。因此建议猪场避免使用或添加同类抗生素，定期对本地分离株进行药敏试验筛选出敏感药物，采取联合用药、交叉用药和轮换用药等方式，可减少耐药性的产生。