β-防御素与奶牛乳腺炎的研究进展

苏布登格日勒 ， 温婧怡 ，张 曼 ， 金 鑫 ， 王云鹤 ， 魏 方 ， 杨银凤

(内蒙古农业大学兽医学院 ， 内蒙古 呼和浩特 010018)

据报道，全球每年仅因奶牛乳腺炎造成的经济损失就高达350亿美元，我国每年因奶牛乳腺炎造成的经济损失也达15亿人民币[1]。奶牛乳腺炎是由革兰阴性菌和阳性菌以及真菌引起的在奶牛中最常见也是最有经济破坏力的疾病，对产奶质量和数量都有较大影响[2]。而在兽医治疗过程中使用抗生素和牲畜淘汰仍为治疗奶牛乳腺炎的主要手段。但也由于乳腺炎治疗过程中抗生素的大量使用对牛奶质量造成了显著影响，如乳制品中抗生素残留，会对饮用这类问题牛奶的人造成生理伤害，从而造成更大范围内的经济损失。到目前为止，尽管奶牛乳腺炎已经得到了较为有效的控制，但它仍是现阶段全球乳业所面临的主要挑战之一。

乳腺炎致病因素非常多，主要原因还是与环境和生物体自身遗传免疫有关[3]。几个世纪以来物种之间易感性的暴露，使得包括天然免疫在内的第一道免疫防线经过不断筛选变得更加适合自然环境生存。而防御素就是生物在长期不断进化中保留的天然免疫中重要组成成分之一。防御素广泛分布于植物以及脊椎动物和无脊椎动物，根据其二硫键和半胱氨酸位置分为α、β和θ-防御素[4]。

作为防御素家族主要成员的β-防御素，是一种富含半胱氨酸的阳离子抗微生物肽[5]。有研究表明，这种半胱氨酸可以保护肽不被消化[6]。近年来发现哺乳动物β-防御素的免疫调节作用可以调节炎症和激活免疫系统。目前在牛体内只发现了β-防御素[7]。而β-防御素也恰恰是牛发生乳腺炎感染之后除了天然性物理免疫屏障之外，最易产生有效防御的物质。

1 牛β-防御素

1.1 牛β-防御素研究发现过程 牛β-防御素包括舌抗微生物肽(Lingual antimicrobial peptide，LAP)，牛嗜中性粒细胞β-防御素(Bovine neutrophil β-defensins，BNBD)，气管抗微生物肽(Tracheal antimicrobial peptide，TAP)以及肠道β-防御素(Enteric β-defensin，EBD)[8]。第一种牛防御素是由Diamond等人从牛呼吸道中分离出来，并被命名为TAP[9]。Selsted在1993年报道发现了13个牛β-防御素序列[10]。2004年， Roosen等人报道了18个牛防御素基因，其中还包括6个新发现的β-防御素基因(DEFB401、DEFB402、DEFB403、DEFB404、DEFB405和LAP like)[11]。随后研究者对牛的各种β-防御素进行了聚类分析，结合人、黑猩猩、老鼠、大鼠和狗上已公布的防御素特征性数据，在牛的第8、13、23、27号染色体上共鉴定出58个基因，分别命名为A簇、B簇、C簇和D簇。其中A簇基因最少，D簇有重要的免疫基因，B簇和C簇的防御素基因在生殖道中表达[12]。研究表明，位于27号染色体上的基因可以抵抗乳腺炎。综合对人、狗、黑猩猩、大鼠和小鼠的线性分析，发现27号染色体D簇上有30个基因，其中11个特定属于牛，包括TAP、LAP、EAP、DEFB4A、DEFB5、BNBD7、BNBD10、BNBD10A、BNBD11、BBD403和BBD1[13]。本文聚焦于在乳腺和乳体细胞中表达的可以作为乳腺炎抵抗力标记的β-防御素。

1.2 与牛乳腺炎有关的β-防御素研究发现过程

1.2.1 LAP LAP首先在炎性鳞状上皮细胞中分离获得[14]。然而除了舌上皮细胞，被感染的肠、呼吸道组织和乳腺上皮细胞中也发现有LAP表达。在母牛乳腺中就报道了有关LAP mRNA的表达，文章描述了乳汁中体细胞计数(Somatic cell count， SCC)与LAP mRNA表达和乳腺组织上皮细胞中mRNA定位之间的正相关关系[15]。但到目前为止尚无研究表明乳腺中存在LAP蛋白。因此，有研究者使用兔子做免疫组化试验，结果表明，LAP在健康的肺泡上皮细胞和乳汁中表达[16]。同时有多项研究表明，LAP是由肺泡上皮细胞分泌到乳汁中，并且对大肠杆菌有抗微生物活性。研究者在探索牛乳中LAP与乳腺炎、乳牛乳房内脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、革兰阴性细菌细胞膜成分对牛乳中LAP浓度的变化的关系时发现，SCC在LPS刺激后2 h开始增加，并保持其高水平直到第5天；乳汁中LAP浓度在LPS 刺激2 h后显著升高，并维持2 d的较高水平[16]。有研究证明，牛奶中的LAP浓度与SCC之间存在显著相关性[17]。这些结果表明，一些细菌成分可以刺激β-防御素分泌到牛奶中。

然而，在Swanson等人的研究中，在注入乳房链球菌野生菌株感染乳腺后，对乳房周围和外部组织进行分析，以及Roosen等人研究了临床诊断为乳腺炎的外部和实质器官，都表明LAP仅在感染牛中表达。值得注意的是牛的饮食类型也影响着LAP在乳房中的表达水平，根据报道，高浓缩饲料可以提高LAP表达水平[18]。根据LAP和SCC之间的显著相关性可以判断在感染了金黄色葡萄球菌、牛链球菌、无乳链球菌和大肠杆菌的牛乳之中LAP表达量比未感染的更高[19]。根据这些基础研究，LAP被确定为牛乳腺炎关联的遗传标记之一。

1.2.2 TAP TAP是首个从哺乳动物气管黏膜分离出的β-防御素[5]。TAP前原肽有64个氨基酸，包含20个氨基酸的信号肽和1个短的前序列(FTQGVG)。TAP还可以被多种病原体以及促炎因子，例如TNF-α、IL-1β 和LTA( Lipoteichoic acid )诱导。除此之外，LPS也可以增加TAP表达水平。根据报道它在健康和感染牛的乳腺细胞中都有表达，不仅如此，TAP在体外感染金黄色葡萄球菌的牛黏膜上皮细胞中也有表达[20]。

1.2.3 DEFB1 DEFB1 mRNA在感染的泌乳组织和非泌乳组织中存在，且在乳腺组织中呈现诱导性表达。DEFB1V1和DEFB1V2是BNBD1的两个变体，是乳腺感染后诱导表达的防御素之一[21]。

1.2.4 DEFB4 DEFB4也被称之为BNBD4，在1993年被首次报道牛肺泡组织中有较高水平的表达，但在小肠组织中表达水平较低[10]。一项研究表明，感染金黄色葡萄球菌后DEFB4在乳腺泡和乳池中呈现高水平表达[22]。DEFB4内含子区域内部分单核苷酸多肽被发现与乳汁成分性状和SCC有关，因此，DEFB4可以确定作为乳腺炎抵抗力的标记。有研究证明，当细菌感染牛乳腺细胞后就会激活奶牛巨噬细胞内的维生素D通路，随后1，25-二羟基维生素D3的活性激素刺激牛单核细胞的一氧化氮和β-防御素，使DEFB4表达水平提高[23]。

1.2.5 DEFB5(BNBD5) DEFB5与DEFB4类似，在牛肺泡表面巨噬细胞呈现高水平表达[24]。研究表明，奶牛感染乳房炎时BNBD5的mRNA表达水平升高。患有乳房炎的乳腺组织中BNBD5表达量比平时升高约13倍[25]。另一个研究证明，在乳腺感染金黄色葡萄球菌时DEFB5表达水平比DEFB4的更高。同样的，凝固酶阳性葡萄球菌对乳腺中DEFB5的表达水平的影响高于凝固酶阴性葡萄球菌，不同的是DEFB4在泌乳早期也呈现这种高水平表达[26]。但遗憾的是，关于BNBD5的研究中目的蛋白的大量获得和最终有明显抑菌作用的纯化蛋白研究报道较少。

1.2.6 DEFB10 相比较而言，感染凝固酶阳性葡萄球菌的乳腺组织第1～2次泌乳中DEFB10的表达水平比第3～4次泌乳更高[25]。而DEFB1、DEFB4、LAP和DEFB5在第3～4次泌乳表达水平更高[25]。此外研究表明，乳汁中嗜中性粒细胞在经过LPS处理后，DEFB10基因表达也出现升高现象[27]。

1.2.7 DEFB103 DEFB103是在27号染色体上新发现的β-防御素，它与D簇上其他的β-防御素几乎没有同源性，对于它在牛上的表达研究极少。根据文献记载DEFB103多态型的四种单倍体与金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎的耐药性和易感性并没有显著关联[28]。

2 牛β-防御素的作用机制

近年来，不管人还是动物体内，多重耐药性和抗生素耐药性已成为趋势。但有趣的是，防御素并没有这方面现象，其中一个可能存在的原因就是防御素在该位置只有少量存在或者一般情况下防御素为隐形存在，当到达作用部位时才发挥作用[29]。根据报道，β-防御素作为两亲性阳离子肽，对于革兰阴性菌、革兰阳性菌、病毒、真菌和其他单细胞寄生虫可以作为抗微生物肽(Antimicrobial peptides，AMPs)发挥作用[30]。

起初，肽通过静电吸引力或者由膜上存在的受体介导与病原体的膜相互作用，在抗微生物肽达到阈值浓度后使细胞透化，随后肽的构像转变。而在某些情况下，膜带负电荷时这种相变才是可行的。这也再次指出防御素区分宿主细胞和靶向细胞的能力[31]。透化之后开始最初的结合和相互作用。

3 牛β-防御素的应用展望

在乳腺炎防治中β-防御素的使用可以提高饲养奶牛动物福利以及减少农民饲养经济成本。研究关于奶牛乳腺炎的β-防御素对社会具有相当重要的实用价值，可以为奶牛乳腺炎防治提供新思路，从而促进全球奶牛养殖的健康发展。

3.1 调整饮食从而对β-防御素表达产生影响 营养物质对个体免疫系统有较大的影响，但就β-防御素来说，不同膳食条件下宿主防御肽(Host defense peptides，HDPs)不同。对于人类，膳食组蛋白脱乙酰酶抑制剂萝卜硫素和丁酸钠被报道用来上调HDPs人类β-防御素-2在Caco-2、HT-29和SW480的表达。在感染大肠杆菌的仔猪，丁酸钠促进HDPs的高表达，并且在此水平下大肠杆菌数量降低[32]。因此，饮食本身有助于更好地抵抗乳腺炎，降低医疗费用。

3.2 建立肽库加速防御素发展应用 牛β-防御素种类已经发现很多，我们可以进一步利用其生物信息建立肽库来全面快速发展防御素在实际生产中的应用。

3.3 根据防御素标记挑选优势奶牛品种 根据前人研究可知，β-防御素可以作为乳腺炎关联遗传标记，并根据此标记对奶牛品种进行人工筛选，选出对乳腺炎抵抗力强的品种进行人工繁育。从而达到乳腺炎优势品种对抵抗力较弱的品种的替代。从而减少奶牛患乳腺炎概率，最终达到减少经济损失的目的。

3.4 替代抗生素 抗生素作为迄今为止治疗乳腺炎的主要手段仍存在重复使用和不当使用的问题，导致近年来抗生素使用效力大幅降低。因此，在未来乳腺炎的治疗中可以考虑利用宿主对抗感染过程中激发的天然免疫所产生的β-防御素作为未来治疗β-防御素的一个潜在工具。因为这些防御素的靶向目标是微生物的整体结构，并且它们是通过调节免疫结构发挥作用[33]。故微生物并没有对β-防御素产生耐药性。另一个原因就是β-防御素特异性强，广泛分布于体内，更有益与其在生产实践中的应用。

3.5 作为佐剂改善疫苗 乳腺预防疫苗是国内外时下的讨论热点，而β-防御素是疫苗佐剂的理想候选物。目前对于人类和禽类的β-防御素作为疫苗佐剂方面研究较多，但在奶牛方面还有较大的研究空白，仍需我们积极研究探索。牛β-防御素的肽可以刺激Th1和Th2应答以及传递免疫佐剂[34]。Mackenzie-Dyck等人表明牛疱疹病毒1疫苗就由BNBD3和糖蛋白D作为佐剂制备的[35]。