南方红豆杉水提物对NCI-N87胃癌裸鼠移植瘤凋亡作用及机制研究

邹媛媛 王亚坤 裴静波

[摘要] 目的 探讨南方红豆杉水提物对HER2阳性人胃癌NCI-N87细胞裸鼠移植瘤的诱导凋亡作用，并初步探索其作用机制。 方法 建立荷瘤裸鼠模型，将60只BALB/c裸鼠接种人HER2阳性胃癌NCI-N87细胞株并随机分组给药及取瘤，TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡，实时荧光定量PCR法检测PI3K、AKT1、mTOR mRNA表达水平。结果 ①中药低、中、高剂量组均可见到凋亡细胞，凋亡率同对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;中剂量联合组差异性最为显著（P<0.01）;②红豆杉各剂量组PI3K mRNA表达均降低（P<0.05），红豆杉联合赫赛汀后明显下调AKT1 mRNA表达，红豆杉中、低剂量组mTOR mRNA表达显著降低（P<0.05）。 结论 ①南方红豆杉水提物可以诱导胃癌细胞的凋亡，联合西药曲妥珠单抗后并未增强其诱导作用;②南方红豆杉水提物可部分下调PI3K、AKT1、mTOR mRNA表达水平。

[关键词] 南方红豆杉水提物;胃癌;凋亡;PI3K/AKT/mTOR

[中图分类号] R730.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）08-0033-04

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis effect of aqueous extract of Taxus Chinensis Var. Mairei on the transplanted tumor of nude mide with HER2-positive human gastric cancer NCI-N87 cells， and to preliminarily explore its mechanism. Methods A model of tumor-bearing nude mice was established. 60 BALB/c nude mice were inoculated into human HER2-positive gastric cancer NCI-N87 cell line and randomLy grouped for administration and tumor-removing. TUNEL assay was used to detect the apoptosis of transplanted tumor cells. The expression levels of PI3K， AKT1 and mTOR mRNA were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. Results ①Apoptotic cells were observed in the low， medium and high dose groups of Chinese medicine， and the apoptosis rate was compared with the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）; the difference in the combined middle dose group was the most significant（P<0.01）; ②The expression of PI3K mRNA in each dose group of Taxus was decreased（P<0.05）. After Taxus combined with Herceptin， the expression of AKT1 mRNA was down-regulated significantly. The expression of mTOR mRNA in the middle and low dose groups of Taxus was significantly decreased （P<0.05）. Conclusion ①The aqueous extract of Taxus Chinensis Var. Mairei can induce apoptosis of gastric cancer cells. Its combination with Western medicine of trastuzumab does not enhance the induction;②The aqueous extract of Taxus chinensis var. mairei can partially down-regulate the expression levels of PI3K， AKT1 and mTOR mRNA.

[Key words] Aqueous extract of taxus Chinensis var. Mairei; Gastric cancer; Apoptosis; PI3K/AKT/mTOR

胃癌是常見恶性肿瘤之一，发病率居高不下，最近的国家癌症中心数据显示，胃癌在男性恶性肿瘤中发病排第2位，女性第5位，预后相对差[1，2]。发表在《柳叶刀》杂志上的全球癌症生存趋势监测计划中，中国胃癌患者的5年生存率虽然从2000～2004年的30.2%提高到2010～2014年的35.9%，却仍旧只有韩国的一半[3]。

资料表明，有12%～35%胃癌患者HER2基因表达阳性[4，5]，在胃癌的发生中，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）信号通路的异常激活起着重要的作用[6]，可受HER2调控，PI3K-AKT信号传导通路异常激活后，可发生肿瘤疾病，并与细胞增殖和凋亡相关[7，8]。现代研究表明，红豆杉可抑制多种肿瘤细胞的生长，能激活T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞，可以促进白介素1、2，TNF-α，干扰素等的合成，以及调节抗体和补体而明显改善免疫功能[9]。南方红豆杉作为中药饮片在临床上已广泛运用，有效并且安全，疗效明确。根据前期南方红豆杉水提物对肿瘤细胞增殖抑制作用的研究[10]，现将体外实验延伸到体内实验，通过建立人胃癌HER2阳性裸鼠移植瘤模型，进一步研究南方红豆杉水提物对HER2阳性胃癌移植瘤的诱导凋亡作用，并探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

南方红豆杉，规格8 g/包，购置于本院中药房，由宁波泰康红豆杉生物工程有限公司生产，生产批号：100513。80 g南方红豆杉浸泡过夜，水煎3次后，将药液混匀经真空抽滤器过滤，电磁炉上浓缩至100 mL，旋转蒸发仪上浓缩至40 mL，真空干燥箱中干燥，按100%浓度计算得率。曲妥珠单抗（Trastuzumab，赫赛汀，Herceptin），规格440 mg/瓶，上海罗氏制药有限公司，生产批号：N3586，贮存于2℃～8℃冰箱中。

1.2 实验动物与细胞株

BALB/c裸鼠60只，4～6周龄，体重18～20 g/只。由上海西普爾-必凯实验动物有限公司提供，生产批号：SCXK（沪）2013-0016，在浙江中医药大学动物实验中心特定病原体（SPF）条件下饲养。人NCI-N87胃癌细胞株购自中科院上海生命科学研究院细胞研究所。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养  用含有10%胎牛血清的RMPI 1640培养液，在37℃、5% CO2饱和湿度条件培养箱内培养，1～2 d更换1次培养液，待细胞长满培养瓶后，加2 mL 0.25%胰酶-EDTA消化，置于培养箱10～15 min，待细胞全部脱落加培养基终止消化，将细胞悬液移至离心管，800 rpm离心5 min，弃上清液，重悬于细胞培养液中按1：2比例进行传代，每3～5天传代一次。

1.3.2 建立模型、分组给药  根据《中药药理研究方法学》计算[11]，裸鼠南方红豆杉低、中、高剂量分别为：成人剂量的5倍：0.520 g/（kg·d），成人剂量的10倍：1.040 g/（kg·d），成人剂量的20倍：2.080 g/（kg·d），灌胃，共给药3周;用传统方法煎成汤剂，配制成药液，使生药含量分别为52 mg/mL、104 mg/mL、208 mg/mL。根据前期实验及参考文献[11]，赫赛汀组首剂按40 mg/kg腹腔注射给药，每7天一次，后两次按20 mg/kg给药，共给药3次。细胞株取对数生长期的接种于动物左侧腋窝下，第7天随机分组，60只BALB/c裸鼠分为空白组、红豆杉高剂量组、红豆杉中剂量组、红豆杉低剂量组、西药联合红豆杉中剂量组，西药单药组，共6组，每组10只。分组后即开始给药，每次3 mL中药浓缩液，空白组予同等体积的生理盐水，共给药3周，第28天取瘤。

1.4 TUNEL法检测

各组移植瘤组织4%多聚甲醛常规固定、石蜡包埋、切片，按照表格比例配置TUNEL检测液，每组切片滴加适量的TUNEL检测液使其完全覆盖，湿盒避光孵育60 min，将切片置于PBS或HBSS溶液中室温浸洗2次，每次5 min，吸干切片上多余的水分，避免干片，滴加0.05 μg/μL的DAPI溶液，室温湿盒避光孵育10 min，将切片置于PBS或HBSS溶液室温浸洗3次，每次5 min，用抗荧光猝灭封片剂封片，染色结束后荧光显微镜下采集图像拍片，激发波长范围450～500 nm，发射波长范围515～565 nm。

1.5 Real-time PCR检测

取适量保存在液氮中的移植瘤组织50 mg放入2 mL EP管中进行组织总RNA的提取和纯化，再吸取1 μL抽提的RNA进行RNA浓度测定，若OD260/OD280为1.8～2.2之间，证明RNA纯度好。引物设计及合成由上海生工公司合成。PI3K（p110α）mRNA上游引物序列为：5-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3，下游引物序列为：5-GGCTACAGTAGTGG-GCTTGG-3，AKT1 mRNA上游引物为：5-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3，下游引物为：5-TTGTAGCCAATA-AAGGTGCCAT-3，mTOR mRNA上游引物为：5-ACCGGCACACATTTGAAGAAG-3，下游引物为：5-CTCGTTGAGGATCAGCAAGG-3。各组裸鼠移植瘤组织总RNA的提取和cDNA的合成按试剂说明书操作。

1.6 统计学处理

所有实验均重复3遍，采用SPSS21.0统计分析软件进行处理，计量资料数据用（x±s）表示，各组间差异用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TUNEL法检测移植瘤凋亡程度

Herceptin及南方红豆杉水提物各组对移植瘤均有诱导凋亡作用（表1、图1、封三图2）。与对照组比较，红豆杉各组及西药组均具有统计学意义（P<0.05），其中中剂量组作用最强，较低、高剂量组作用均更显著（P<0.01），并未呈现剂量-效应关系;红豆杉中剂量组与西药组比较，差异不显著（P>0.05）;红豆杉中剂量联合西药组与西药组及红豆杉各单药组相比，差异不显著（P>0.05），红豆杉低剂量、高剂量组及联合组间差异不显著（P>0.05）。

2.2 Real-time PCR检测PI3K、AKT1、mTOR基因表达

结果显示（表2、封三图3）：与对照组相比，各治疗组PI3K mRNA表达降低（P<0.05），红豆杉中剂量组及赫赛汀组PI3K mRNA表达极显著降低（P<0.01）;红豆杉单药组AKT1 mRNA表达差异无统计学意义，红豆杉中剂量组AKT1 mRNA表达较红豆杉高、低剂量组显著降低（P<0.05），红豆杉联合赫赛汀组AKT1 mRNA表达显著降低（P<0.05）;红豆杉中剂量组mTOR mRNA表达显著降低（P<0.05），红豆杉联合赫赛汀组mTOR mRNA表达极显著降低（P<0.01）。与赫赛汀组相比，红豆杉联合赫赛汀组各基因表达差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

HER2属于表皮生长因子受体（EGFR）家族，是一种原癌基因，其在组织中基因扩增及过度表达与细胞的癌变及多种恶性肿瘤的预后关系密切。其中曲妥珠单抗（Trastuzumab，商品名Herceptin）是重组的人源化抗HER2的单克隆抗体，能与人HER2胞外受体结合，抑制HER2参与的信号传导[12，13]，起抑制肿瘤的作用。PI3K/AKT/mTOR信号通路激活可受HER2调控，HER2能活化PI3K，PI3K进一步催化4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol4，5-bisphosphate，PIP2）转化生成3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3），轉移AKT到达细胞膜内面，在PDK1和mTORC2作用下激活AKT，其是PI3K/AKT通路的主要节点，主要参与调节细胞抗凋亡[14]。活化的AKT进一步激活下游因子，如mTOR，调节细胞周期、凋亡和新生血管生成。AKT的三个亚型有80%以上的氨基酸序列同源性，相似的结构，存在共同结构特征于三个不同的功能区域，三个亚型均参与下游底物的活化[15]，其中AKT1促进细胞存活和增殖并在，并在肿瘤的发生、细胞生长、增殖过程中起重要作用。PI3K/AKT/mTOR信号通路的阻断，可以通过抑制此信号通路上的各个靶点，例如siRNA靶向阻断I型PI3K，从而阻断PI3K信号通路，导致肿瘤细胞的凋亡[16-18]，还可以通过阻断AKT通路的激活，进一步抑制其下游信号靶点激活从而导致信号通路的阻断，达到抑制肿瘤细胞的生长[19，20]。

本实验结果表明，各治疗组均存在细胞的凋亡现象，赫赛汀单药组也有诱导凋亡作用，红豆杉水提物的抑瘤作用可以通过诱导凋亡发生，但随着红豆杉剂量的增加，并未出现相关浓度依赖性，即随着药物浓度的增高其凋亡发生情况并未增多，可以发现中剂量单药组效果最好，而中剂量联合西药组效果并未优于红豆杉单药组，也未优于西药组，为何这样的一个结果？是否因药物不同组合后，或采用不同的给药方式后，肿瘤的发生作用有不同的改变，进而抗瘤机制也随之发生了相应改变;或者在加入西药靶向药物曲妥珠单抗后，肿瘤细胞的生长被阻滞于特定时期，曲妥珠单抗可上调细胞周期蛋白激酶抑制剂p27kip蛋白的表达，诱导细胞周期G1期停滞[21]。而中药能诱导凋亡作用的信号通路被抑制或者阻滞，相关靶点不能被激活，从而诱导凋亡作用下降。曲妥珠单抗可以有多途径抑制肿瘤细胞生长，南方红豆杉作为中药在运用于肿瘤治疗过程中是否影响肿瘤微环境发生改变，加入曲妥珠单抗后其介导免疫应答、抑制血管内皮生长因子、改善细胞膜通透性及阻断PI3K/AKT信号通路等[22，23]均影响其抑瘤作用，从而产生这样的结果，具体的深入机制尚需进一步研究。本实验还从基因角度对其诱导凋亡机制进行了初步探索，实验结果表明不同剂量组能部分下调PI3K、pAKT、mTOR基因表达，且中剂量组下调程度较其它治疗组明显，高、低剂量组及联合组下调pAKT程度相当，值得注意的是红豆杉联合赫赛汀后较红豆杉单药组下调各靶点的表达并未显著增强，这些差异提示虽然部分抑制了此信号通路的激活，HER2阳性胃癌仍可以通过其他信号通路起到抑制肿瘤细胞增殖作用。当然我们也不能排除实验本身因素，NCI-N87细胞出现的耐药性，我们没有进一步检测，这也是课题组进一步研究的方向，靶向药物固然效果优势明显，但不可否认临床上大部分接受曲妥珠单抗治疗有效的患者往往1年内产生耐药[5]。

综上所述，南方红豆杉水提物可以促进胃癌细胞的凋亡，其中剂量组诱导作用较强，与西药组相当;南方红豆杉水提物可以通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制该信号通路相关靶点，导致细胞凋亡;另外，通过实验也发现存在除PI3K/AKT/mTOR信号通路外其他旁路或下游通路等从而抑制HER2阳性胃癌发展的机制。

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