C1QBP在非小细胞肺癌中的表达及生物信息学分析

李维 张永红 刘旋 张红妮 邓文静 钟玉洁 马莉 张娜 杨拴盈

1西安交通大学第二附属医院呼吸与危重症医学科 710004；2西安交通大学第二附属医院病理科 710004

肺癌是严重危害人类健康的疾病,其发病受环境、基因等多因素影响,并且不易早期发现,治疗效果不佳。肺癌是我国近10年病死率最高的肿瘤[1],也是美国预测2018年病死率最高的肿瘤[2]。肺癌中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)达85%,近年来,靶向治疗及免疫治疗在NSCLC的应用,显著延长部分患者的疾病缓解期,但治愈肺癌的目标仍任重而道远,研究NSCLC发病机制寻找更有效的治疗方法仍然是目前研究的重点。本课题前期通过肺腺癌线粒体蛋白质组学研究,筛选出一系列差异蛋白,其中补体成分1q亚单位结合蛋白(complement component 1q subcomponent binding protein,C1QBP)在肺腺癌组织细胞和正常肺组织细胞间的差异超过2倍。C1QBP在多种肿瘤中表达均升高[3],而其与NSCLC的相关研究少见报道。本研究将进一步检测组织标本中C1QBP蛋白的表达,结合临床特征进行分析,并对C1QBP进行生物信息学分析,为进一步探究其在NSCLC发生中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 组织来源 46例肺癌组织标本取自西安交通大学第二附属医院手术病例标本,其中24例同时收集癌旁＞5 cm 处正常肺组织标本,其中男30例,女16例;年龄(57.7±8.6)岁,年龄范围为43～75岁,其中＜60岁25例,≥60岁21例;组织低分化23例,高分化23例;根据国际抗癌联盟2017年第8版TNM 分期标准：Ⅰ期/Ⅱ期25例,Ⅲ期/Ⅳ期21例;24例无淋巴结转移,22例有淋巴结转移;腺癌26例,鳞癌20例。所有入选病例术前未经放、化疗,无肝硬化、自身免疫病等合并症,术后经病理确诊为肺癌。组织标本经10%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片备用。本研究经西安交通大学第二附属医院伦理委员会批准(2019002)。

1.2 主要试剂 兔抗人C1QBP 多克隆抗体(英国Biorbyt公司),SP9001生物素-链霉卵白素免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),脱脂奶粉,其它实验试剂均为国产分析纯。

1.3 免疫组织化学染色 石蜡组织标本切成4μm切片,常规脱蜡和水化,加柠檬酸缓冲液后置于微波炉中进行抗原修复,3%H2O2孵育,正常山羊血清封闭抗体,滴加稀释的一抗兔抗人多克隆抗体C1QBP(1∶200),4 ℃冰箱过夜,滴加二抗工作液孵育,辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素孵育,DAB显色,苏木精溶液复染,脱水,晾干后中性树胶封片。用已知阳性片作为阳性对照,PBS 代替一抗作为阴性对照。

由1位主治医师和1位副主任医师采取双盲法进行免疫组织化学结果判断[4],以细胞中出现棕黄色颗粒为阳性,每例随机观察5个高倍镜视野,每个视野大于200个细胞。采用半定量积分法判定结果,根据阳性细胞所占百分比(无细胞着色为0分;＜10%为1分;10%～50%为2分;＞50%为3分)和染色强度(未着色为0 分;淡黄色为1分;中度黄色为2分;棕黄色为3分)进行评分,将2种分值相乘：0分为“-”,1～4分为“+”,＞4分为“++”。定 义“-”为阴性表达,“+、++”为阳性表达。

1.4 生物信息学分析 采用NCBI数据库查询C1QBP(Q07021)蛋白质序列,在此基础上,利用ExPASy中的ProtParam 在线工具进行理化性质分析。其中包括：氨基酸数量、蛋白相对分子质量、理论p I值,氨基酸组成、分子式、蛋白半衰期、稳定性、亲/疏水性等。利用SOPMA、PDBe对C1QBP的二级结构进行分析,利用TMpred和SMART 对跨膜结构和结构域进行预测,利用Prot Fun 2.2 Server进行蛋白质功能分析,采用STRING 数据库预测C1QBP相互作用蛋白,并分析可能作用的信号通路。

1.5 统计学分析 所有数据应用SPSS 16.0软件进行处理,采用Fisher确切概率法分别分析腺癌和正常组织,鳞癌和正常组织的组间差异。C1QBP阳性表达程度和患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结转移及肿瘤类型的关系采用Spearman系数进行比较分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学结果 在肺腺癌和鳞癌中C1QBP以棕黄色颗粒主要表达于胞浆,在高表达的组织中细胞核也有表达,而在正常肺组织中表达量很少(图1～3)。在肺腺癌组织中表达阳性率为92.31%(24/26),而在正常肺组织中表达阳性率为37.50%(9/24)(P＜0.001),差异有统计学意义;在肺鳞癌组织中表达阳性率为95.00%(19/20),与正常肺组织比较差异有统计学意义(P＜0.001),见表1。进一步采用Spearman相关系数来分析C1QBP 阳性表达的程度和患者年龄、性别、肿瘤分化程度、TNM 分期、淋巴结转移及肿瘤类型的关系(表2)。研究结果提示,C1QBP 阳性表达的程度和患者的年龄、性别、TNM 分期、淋巴结转移及肿瘤类型均无关,和患者肿瘤细胞的分化程度有关。

图1 补体成分1q亚单位结合蛋白在肺腺癌中的表达IHC ×400

图2 补体成分1q亚单位结合蛋白在肺鳞癌中的表达IHC ×400

图3 补体成分1q亚单位结合蛋白在癌旁正常肺组织的表达 IHC ×400

表1 C1QBP在非小细胞肺癌和正常肺组织中的表达(例)

表2 C1QBP表达的分级和患者临床特点的关系(例)

2.2 生物信息分析结果 C1QBP 蛋白全序列由282 个氨基酸组成,蛋白相对分子质量为31 362.24,理论p I为4.74,其组成中含量相对较多的氨基酸包括：谷氨酸10.3%,亮氨酸11.0%,天冬氨酸7.1%,色氨酸7.1%,甘氨酸7.1%。分子式为：C1379H2169N375O440S10。哺乳动物网状细胞体外研究估计半衰期为30 h。C1QBP的不稳定系数为48.69,提示该蛋白是不稳定的。而脂溶指数为79.86,其总的平均亲水性系数(GRAVY)为-0.461。

UniProt KB在线查询C1QBP(Q07021)的氨基酸序列见图4,SOPMA 软件对C1QBP 二级结构进行预测,主要包括无规则弯曲(47.87%)、α-螺旋(32.98%)、延 伸 链(15.25%)、β 转 角(3.90%),见图5、6。在PDBe 数据库中查询C1QBP的三级结构已知为：3RPX(图7)。

图4 补体成分1q亚单位结合蛋白的氨基酸序列

图5 SOPMA 软件对补体成分1q亚单位结合蛋白二级结构预测统计结果

图6 SOPMA 软件对补体成分1q亚单位结合蛋白二级结构预测分布图

运行在线工具TMpred对C1QBP 蛋白的跨膜结构域进行预测,结果提示并未发现有显著意义的跨膜结构域。运用在线工具SMART 发现C1QBP蛋白质在序列的86-279 位氨基酸之间存在MAM33结构域(图8)。

图7 PDBe数据库中补体成分1q亚单位结合蛋白的三级结构

图8 SMART 数据库中的补体成分1q亚单位结合蛋白蛋白质的结构域

利用Prot Fun 2.2 Server对C1QBP 进行功能分析发现,C1QBP 最有可能的功能分类依次是：信号转导、应激反应、免疫反应、激素等(表3)。

表3 Prot Fun 2.2 Server中C1QBP功能初步分析结果

采用STRING 数据库预测C1QBP相互作用蛋白。STRING 数据库扩大了相互作用的预测范围,该数据库包含了直接(物理上)和间接(功能上)的各种相互作用关系,数据结果根据基因背景、高通量实验、共表达和已知信息综合所得,并对每一个相互作用关系进行评分,该数据库目前涵盖了来自1 133个物种的5 214 234种蛋白质的相互作用信息。STRING 数据库预测C1QBP 评分最高的10种蛋白质依次为： 激肽原1(kininogen-1,KNG1)、血浆激肽释放酶、凝血因子Ⅻ(coagulation factorⅫ,F12)、脯氨酰羧肽酶、凝血因子Ⅺ(coagulation factor Ⅺ,F11)、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族G1、富含丝氨酸/精氨酸剪接因子1、糖蛋白9、α-2-巨球蛋白、血小板膜糖蛋白(图9)。

图9 STRING 数据库中C1QBP相互作用蛋白预测结果

3 讨论

C1QBP又称人透明质酸结合蛋白、P32 或gC1q R,为酸性蛋白,主要定位于线粒体,也可存在于细胞膜、细胞核、内质网和高尔基体等其他部位[5]。编码C1QBP 旳基因位于人染色体17p12-13[6],包括6 个外显子和5 个内含子。蛋白质的一、二及三级结构是它的功能的基础,最终形成的成熟的C1QBP蛋白具有特殊的晶体结构：3个单体分子形成1个中空圆环型的三聚体,并有1个三重对称轴,这种结构大大提高了其与配体的结合能力[7]。在线工具SMART 发现的C1QBP 结构域MAM33,是结合C1Q 球型头部结构的关键,和线粒体氧化磷酸化及细胞核与线粒体的相互作用有关,在C1QBP的功能中有重要作用[8]。

ProtFun 2.2 Server分析结果表明C1QBP 最有可能的功能分类依次是：信号转导、应激反应、免疫反应等。生物信息学分析C1QBP缺乏跨膜结构,并且是不稳定蛋白,因此,其只有通过与其他跨膜蛋白相互作用来传导细胞内信号。C1QBP 脂溶指数达79.86,亲水性系数为负值,既有亲水部分,又有疏水部分,为和其他蛋白的结合奠定了结构基础。C1QBP通过L1CAM 影响肿瘤细胞的黏附和转移,并通过调节GSK3/β-Catenin/L1CAM信号通路调节肾癌细胞的转移[9];锌指蛋白32是氧化剂刺激后细胞存活的关键,C1QBP 是锌指蛋白32的直接靶基因,两者结合使p38MAPK 途径失活,从而发挥锌指蛋白32对氧化应激诱导的细胞凋亡的保护作用[10]。C1QBP 还可与C1Q 结合可以调节多种免疫应答[11],抑制淋巴细胞的增殖,影响成纤维细胞和内皮细胞的黏附等。C1QBP 与SF2/ASF/SRSF1结合,激活m TOR C1信号通路引起细胞增殖[12]。因此,C1QBP是一种多功能伴侣蛋白,有多种不同的生物功能[13]。

本实验采用免疫组织化学法检测NSCLC 和正常肺组织C1QBP的表达,发现肺腺癌和鳞癌组织中C1QBP的表达明显高于正常肺组织,并且表达阳性的程度和肿瘤组织分化程度呈正相关,但未发现和肺癌的TNM 分期和淋巴结转移有关。查阅文献,C1QBP 在乳腺癌[14]、卵巢癌[15]、子宫内膜癌[16]、胃癌[17]、肝癌[18]、结肠癌[19]和宫颈癌[20]等多种肿瘤组织中表达增多。在乳腺癌中,C1QBP的m RNA 和蛋白水平在乳腺癌组织中的表达与正常组织相比明显升高[21],并和乳腺癌患者的TNM 分期、淋巴结转移及肿瘤的复发相关,C1QBP 高表达是乳腺癌的不利预后因素[22-23],C1QBP可能是诊断乳腺癌的分子标志物。在卵巢癌组织中,C1QBP 蛋白水平与淋巴结转移相关[15]。在子宫内膜癌组织中,C1QBP 的表达与子宫内膜癌的恶性程度、肿瘤的复发、转移以及不良预后相关[16],C1QBP可能是子宫内膜癌的独立预后因素。虽然本研究未发现C1QBP表达的强弱和肺癌的淋巴结转移及TNM 分期有关,但是实验结果C1QBP在肺腺癌和鳞癌中表达升高是肯定的,因此,C1QBP和肺癌的发生很可能有关,有望成为NSCLC新的诊断标志物和治疗靶点。

STRING 数据库预测的C1QBP相关蛋白中得分最高的是KNG1,KNG1是高相对分子质量激肽原、低相对分子质量激肽原和缓激肽的前体,C1QBP可以招募C1Q 和高相对分子质量激肽原形成强大的血管生成因素,促进肿瘤新生血管的形成,促进肿瘤生长和转移[24]。肿瘤细胞在增殖中C1QBP增多,C1QBP会通过中和补体来防止宿主介导的细胞损伤,使肿瘤细胞逃脱机体的免疫系统,增加存活的机会。C1QBP 还能够激活补体和激肽释放酶系统来形成有效的血管活性肽,包括缓激肽,从而增加血管的渗漏,促进肿瘤细胞的逃逸,促进肿瘤的转移和血管生成[25]。由此可见,C1QBP在肿瘤细胞的免疫逃逸、血管生成和转移中均有重要作用,以C1QBP为治疗靶点,可以起到广泛的抗肿瘤作用[13]。

STRING 数据库 预 测 的C1QBP 相 关 的10 个蛋白中有7 个蛋白(KNG1、血浆激肽释放酶、F12、F11、丝氨酸蛋白酶抑制剂家族G1、糖蛋白9、血小板膜糖蛋白)均和凝血有关。现有研究表明,凝血酶与其凝血酶受体1 结合经p44/42 MAPK 信号通路途径可提高血管内皮生长因子m RNA 的稳定性,增强VEGF 合成及释放,为肿瘤的生长、转移提供血供;同时通过降低内皮细胞与膜基底蛋白的连接能力,促进细胞外基质降解,利于肿瘤细胞迁移[26]。F12和F11这2个凝血因子均在凝血过程中和凝血酶有重要联系,F12 和F11也是和C1QBP有重要联系的蛋白,由此推测,C1QBP也可能通过p44/42 MAPK 这一信号通路引起肺腺癌的发生及转移,这是我们下一步研究的重要方向。

综上所述,本实验通过免疫组织化学检测发现了C1QBP在NSCLC 中的表达明显升高,生物信息学方法进一步验证了C1QBP 和肿瘤的相关性,并推测了可能的作用机制。因此,C1QBP 很可能成为NSCLC新的诊断标志物和治疗靶点,但其确切的诊断及治疗价值和作用机制,仍需进一步的深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突