miR-152-3p靶向IGF1基因对高糖诱导的ARPE-19细胞活性和凋亡的影响

李 博，陈金鹏，胡 璇，吴淑君，瞿文博

0引言

糖尿病视网膜病变是糖尿病严重并发症之一，其发病率随着糖尿病发病率的升高而逐年上升。糖尿病视网膜病变是糖尿病常见的微血管病变之一，具有特异性改变的眼底，引起患者视力严重受损，影响着患者的身心健康[1]。糖尿病视网膜病变的特征是毛细血管周细胞早期丢失和基底膜增厚，这可能导致内皮细胞过度增殖，并随后导致血管生成[2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)能够促进血管生成，增强毛细血管细胞通透性，参与糖尿病视网膜病变[3]。据报道，高葡萄糖可增加视网膜色素上皮细胞和血管内皮细胞中VEGF蛋白水平，且糖尿病视网膜病变和其他与新生血管形成相关的眼部疾病中VEGF水平亦增加[4]。因此，通过了解其发展和进展的分子机制，开发针对糖尿病视网膜病变的新型治疗策略具有重要的意义。微小RNA(miRNA)是一类新的小型、高度保守的非编码RNA，可作为转录后调节因子。它们与靶mRNA的3’-UTR结合，并通过诱导mRNA降解或抑制蛋白质翻译来调节转录后水平的基因表达[5]。最近研究发现miRNA在糖尿病及其并发症中发挥重要调控作用[6-7]。miR-152-3p属于高度保守的miRNA家族，它调节血管生成因子的释放，可能参与控制血管完整性和血管生成，这对糖尿病视网膜病变的发展至关重要[8-9]。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)是与多种生物学特性相关的重要生长因子，如细胞增殖、分化、存活和成熟等[10]。据报道IGF1参与视网膜增殖膜的发展，这是一层病理组织，是糖尿病视网膜病变非常重要的病理条件[11]。前期研究[12-13]发现miR-206通过靶向IGF1增强鼻咽癌的放射敏感性，miR-422a通过靶向IGF1抑制胶质瘤的增殖和侵袭。本研究前期通过生物信息学软件预测得到miR-152-3p与IGF1存在靶向结合位点。本实验确定了miR-152-3p与IGF1 mRNA直接相互作用，以调节高糖条件下ARPE-19细胞中VEGF的表达。结果表明miR-152-3p及其靶向IGF1可能为糖尿病视网膜病变的治疗提供新的见解。

1材料和方法

1.1材料ARPE-19细胞株购自中国科学院武汉细胞库；DMEM高糖和正常糖培养基、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；胎牛血清、Trizol试剂购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自杭州四季青工程材料有限公司；miR-152-3p mimics及mimics control购自上海吉玛制药技术有限公司；二甲基亚砜购自上海生工生物工程有限公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司；逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；SYBR premix Ex Taq试剂盒、Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自日本TaKaRa公司；MTT购自美国Sigma公司；VEGF抗体、IGF1抗体、GAPDH抗体及二抗购自美国Abcam公司。pGLO载体购自美国Pronema公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京原平皓生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养ARPE-19细胞接种于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，在37℃，5%CO2培养箱中培养。每天观察培养瓶中贴壁细胞生长和增殖情况，每2d换液1次，待细胞生长汇合达90%时，弃原细胞培养液，以0.25%胰蛋白酶消化传代。取生长状态良好且属同一代的细胞用于后续实验。

1.2.2实验分组对数生长期的ARPE-19细胞接种于96孔板中，置37℃培养箱继续培养24h，用不含血清培养基更换原培养基，饥饿处理12h使细胞同步化。将细胞随机分为四组：(1)正常对照组：含5.5mmol/L葡萄糖的DMEM培养基；(2)高糖组：含30mmol/L葡萄糖的DMEM培养基；(3)高糖+miR-152-3p组：细胞转染miR-152-3p mimics后以含30mmol/L葡萄糖的DMEM培养基干预；(4)高糖+NC组：细胞转染mimics control后以含30mmol/L葡萄糖的DMEM培养基干预。细胞转染采用脂质体转染法，具体操作步骤参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行。各组细胞置37℃培养箱中继续培养。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖情况正常对照组、高糖组、高糖+miR-152-3p组和高糖+NC组细胞接种于96孔板，接种密度为2×104个细胞，置37℃培养箱分别培养24、48、72h，各个时间点在每孔细胞中添加MTT溶液(浓度为5mg/mL)10μL，37℃孵育4h，吸去上清液后再在每孔细胞中添加二甲基亚砜100μL，于震荡仪上振荡10min，至沉淀完全溶解，用酶标仪在波长490nm处读取吸光度值(A值)，计算各组ARPE-19细胞增殖活性。

1.2.4流式细胞术检测正常对照组、高糖组、高糖+miR-152-3p组和高糖+NC组细胞培养48h后，用胰蛋白酶消化贴壁生长的细胞，离心收集细胞至1.5mL EP管中，用凋亡孵育缓冲液冲洗并重悬细胞，调整细胞密度为2×106个，分别在细胞中添加Annexin Ⅴ-FITC 5μL，室温避光反应15min，再加入PI染液5μL，4℃避光孵育30min，上流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，统计细胞凋亡率。

1.2.5荧光定量PCR检测以上各组ARPE-19细胞处理48h后以Trizol法提取细胞中总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。采用SYBR premix Ex Taq试剂盒进行荧光定量PCR扩增。反应条件为95℃ 5min，95℃ 20s，60℃ 30s，72℃ 20s，共40个循环。得出的Ct值采用2-△△Ct法计算相对表达水平，以U6为内参，计算miR-152-3p相对表达水平，所用引物如下：miR-152-3p上游:5’- ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAG -3’; 下游：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA-3’。U6上游:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；下游：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.6 Western blot检测以上四组ARPE-19细胞处理48h后，分别收集各组细胞，以0.25%胰蛋白酶消化后用预冷的PBS洗涤细胞3次，分别加入蛋白裂解液置冰上裂解细胞，提取细胞中总蛋白。取等量蛋白样品行SDS-PAGE电泳，分离蛋白后将凝胶上的蛋白质转印至硝酸纤维素膜上。以质量分数为5%脱脂奶粉封闭液中反应2h，常规加入一抗VEGF(1∶500稀释)、IGF1(1∶800稀释)、GAPDH(1∶500稀释)，4℃过夜孵育。PBST洗膜3次，加入二抗(1∶3000稀释)室温孵育2h。PBST洗膜3次，以ECL化学发光，显影、定影，成像系统拍照，以Image J图像分析系统分析个条带灰度值。GAPDH为参照，目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验采用生物信息学TargetScan软件预测miR-152-3p与IGF1基因存在靶向结合位点，扩增与miR-152-3p结合的IGF1 3’-UTR序列并构建到pGLO载体上，同时将进行结合位点序列点突变的IGF1 3’-UTR序列并构建到pGLO载体上，采用脂质体转染将重组载体IGF1-WT-pGLO或IGF1-MUT- pGLO与miR-152-3p mimics共转染于ARPE-19细胞，同时设置共转染mimics control为对照，培养48h后分别收集各组细胞，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞中海肾荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性，以二者比值表示相对荧光素酶活性。

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

表1 各组ARPE-19细胞相对细胞活性比较

注：aP<0.05vs正常对照组；cP<0.05vs高糖+NC组。

表2 各组ARPE-19细胞miR-152-3p、IGF1和VEGF表达水平比较

注：aP<0.05vs正常对照组；cP<0.05vs高糖+NC组。

2结果

2.1 MTT法检测各组ARPE-19细胞活性MTT法检测显示，处理24h时，与正常对照组比，高糖组ARPE-19细胞相对细胞活性降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与高糖+NC组比，高糖+miR-152-3p组ARPE-19细胞相对细胞活性升高，差异也无统计学意义(P>0.05)。处理48、72h时，与正常对照组比，高糖组ARPE-19细胞相对细胞活性降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖+NC组比，高糖+miR-152-3p组ARPE-19细胞相对细胞活性升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组比，高糖+NC组相对细胞活性无统计学意义(P>0.05)，见表1。提示高糖处理能够抑制ARPE-19细胞活性，转染miR-152-3p mimics能够逆转高糖诱导的细胞活性抑制作用。

图2 Western blot检测各组细胞中IGF1和VEGF蛋白水平。

2.2流式细胞仪检测各组ARPE-19细胞凋亡率各组细胞处理48h后，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况(图1)，正常对照组、高糖组、高糖+miR-152-3p组和高糖+NC组细胞凋亡率分别为(3.15±0.36)%、(12.59±1.16)%、(5.44±0.61)%、(13.14±1.18)%。与正常对照组比，高糖组ARPE-19细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖+NC组比，高糖+miR-152-3p组ARPE-19细胞凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组比，高糖+NC组细胞凋亡率无统计学意义(P>0.05)。提示高糖处理能够诱导ARPE-19细胞凋亡，转染miR-152-3p mimics能够回调高糖诱导的细胞凋亡。

2.3各组ARPE-19细胞中miR-152-3p、IGF1和VEGF表达水平RT-PCR和Western blot检测处理48h各组细胞中miR-152-3p、IGF1和VEGF表达水平，见图2，表2。与正常对照组比，高糖组miR-152-3p表达水平明显降低，IGF1和VEGF蛋白表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与高糖+NC组比，高糖+miR-152-3p组miR-152-3p表达水平明显升高，IGF1和VEGF蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与高糖组比，高糖+NC组细胞中miR-152-3p、IGF1和VEGF表达水平均无统计学意义(P>0.05)。提示高糖处理能够下调ARPE-19细胞中miR-152-3p的表达，上调IGF1和VEGF的表达；转染miR-152-3p mimics能够上调miR-152-3p的表达，且可抑制IGF1和VEGF的表达。

图3 miR-152-3p与IGF1 3’-UTR靶向结合位点示意图。

表3 miR-152-3p靶向IGF1 3’-UTR相对荧光素酶活性比较

注：aP<0.05vsmimics control组。

2.4双荧光素酶报告基因实验验证miR-152-3p靶向调控IGF1通过生物信息学软件TargetScan分析结果显示，IGF1是miR-152-3p的靶基因，二者靶向结合位点见图3。双荧光素酶报告基因实验结果显示，IGF1-WT-pGLO共转染中与mimics control组比，miR-152-3p mimics组相对荧光素酶活性明显降低，差异有统计学意义(t=10.775，P<0.05)；IGF1-MUT-pGLO共转染中与mimics control组比，miR-152-3p mimics组相对荧光素酶活性无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。提示IGF1是miR-152-3p的靶基因。

3讨论

ARPE-19细胞是视网膜色素上皮细胞中最常用于体外研究的细胞之一，本研究以ARPE-19细胞为基础，探究糖尿病视网膜病变的相关机制。糖尿病视网膜病变的特征在于毛细血管周细胞的早期脱落和由此导致的血管生成[14]。IGF1通常由肝细胞合成和分泌，并通过与特异性受体IGF1R的结合发挥作用，在结构上，IGF1与前胰岛素高度同源。有证据表明IGF1基因参与了糖尿病视网膜病变的发展[15]。与此一致，本研究表明，与正常对照组ARPE-19细胞相比，高糖能够诱导ARPE-19细胞中IGF1的高表达。最近，随着研究的深入，发现微小RNA参与糖尿病相关并发症的发生和进展[16]。目前报道[17]显示几种miRNA在高血糖条件下差异表达。在本实验中，高糖降低了视网膜色素上皮细胞ARPE-19中miR-152-3p的表达。提示IGF1与miR-152-3p的表达呈负相关性。在本研究中，预测miR-152-3p是靶向IGF1的miRNA，因此推测miR-152-3p靶向IGF1可能参与糖尿病视网膜病变的发病机制。在多种类型的癌细胞中miR-152-3p的表达降低，有研究显示miR-152-3p通过靶向TMM 97在前列腺癌中扮演抑癌因子的作用[18]，还可调节胶质瘤细胞凋亡和侵袭调控[19]。据报道，血浆hsa-miR-152-3p水平与2型糖尿病患者的糖尿病肾病有关[20]。因此本研究前期使用生物信息学软件TargetScan预测IGF1和miR-152-3p之间存在靶向结合关系。为验证miR-152-3p和IGF1之间的靶向调节关系，本实验构建了IGF1-WT-pGLO和IGF1-MUT-pGLO荧光素酶载体。结果显示，当用IGF1-WT-pGLO荧光素酶载体转染细胞时，miR-152-3p过表达抑制相对荧光素酶活性表达，但在IGF1-MUT-pGLO组中未被抑制。这些结果证明IGF1是miR-152-3p的靶基因。

VEGF是与血管生成、癌发生和转移相关的关键调节因子。胰岛素上调VEGF表达，这种作用是由胰岛素受体介导的[21]。胰岛素对VEGF表达的上调已被认为是糖尿病视网膜病变恶化的潜在解释[22]。VEGF的过表达是糖尿病视网膜微血管病理性增生的重要原因之一。高糖诱导能够导致VEGF的分泌增加[23]，与本研究一致。本研究通过高糖诱导，可促进ARPE-19细胞中VEGF表达。此外本实验还发现高糖孵育48h后ARPE-19细胞活性显著降低，凋亡率升高。因此，高糖诱导的VEGF表达的增加，被认为是ARPE-19细胞活性降低、凋亡增加的可能原因。为了进一步证实miR-152-3p对VEGF表达的抑制作用以及ARPE-19细胞活力和凋亡是通过靶向IGF1实现的，本实验用miR-152-3p的模拟物转染细胞进行IGF1和VEGF表达的干扰。结果显示，转染miR-152-3p mimics抑制了ARPE-19细胞中IGF1和VEGF的表达，上调miR-152-3p的表达可部分逆转高糖处理的细胞活力的降低及凋亡的增加。

总之，本研究的结果表明，miR-152-3p的过表达抑制了IGF1的表达，导致VEGF途径蛋白的下调，回调了ARPE-19细胞活力，减少细胞凋亡。本研究进一步阐明了糖尿病视网膜病变的发病机制，miR-152-3p可能成为糖尿病视网膜病变的潜在治疗靶点。