低剂量电离辐射环境下微生物群落物种多样性的产生和维持机制

许心铭，胡大伟，付玉明，张金晖，刘红

（北京航空航天大学 生物与医学工程学院 环境生物学与生命保障技术研究所，北京 100083）

引 言

电离辐射对微生物具有杀伤作用，高剂量电离辐射可用于消毒灭菌，因此对于微生物来说，电离辐射是一种逆境因子。但越来越多的研究发现，在低剂量电离辐射（Low-Dose Ionizing Radiation，LDIR）环境下，微生物却能够很好地生长。与无电离辐射的自然环境相比，它们不仅数量众多，而且种类异常丰富[1-6]。LDIR是指剂量低于200 mGy或剂量率低于0.1 mGy/min的电离辐射。例如空间站外表面由于有一层厚厚的防护，可以抵挡高能量宇宙射线，因此其内部的生物一直处于LDIR环境中（辐射强度约为地面的120倍）。截止目前，国际空间站上已发现了84种微生物，其中细菌49种，包括葡萄球菌、链球菌和杆菌等；真菌35种，包括黄曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、桔灰曲霉、腊叶芽枝霉、枝状枝孢霉和细基格孢霉等。经分析，空间站微生物菌落的生物多样性大大高于地面上无电离辐射的类似环境下滋生的微生物菌落[1,7]。空间站微生物的大量滋生危害极大，已知某些微生物种类不仅会严重威胁宇航员的健康，而且还会加速设备和元器件的腐蚀，导致空间站运行异常，极大地危害着航天任务的安全[1,8]。

然而据统计空间站可被微生物利用的底物种类不超会过30种[1]，而生态学中的竞争排斥原理（Competitive Exclusion Principle）阐明在同一营养级上如果多种生物稳定共存的话，那么生物的种类数目不能多于可获得资源的种类数目，否则就会出现竞争排斥现象，竞争的结果只有少数生物种群（经生态位分化后）可以共存[10]。那么为什么在空间站LDIR环境下，当微生物的种类数目大大多于生长基质的情况下，微生物种群之间并没有发生明显的竞争排斥现象，微生物群落却呈现出生物多样性稳定响应，目前仍没有一个令人满意的解释。

Kudryasheva发现海洋细菌对LDIR的响应过程包括明显的3个阶段—延迟期、促进期和抑制期[9]，闵锐等发现经过一段缓慢生长的适应期后，LDIR可诱导生物细菌产生“适应性反应”和“兴奋（Hormesis）效应”[11]。美俄合作在国际空间站执行的名为“Biorisk”空间微生物研究试验，从2005年1月开始，历时1.5年，采用的是生存能力较强的真菌孢子。将微生物的孢子分别在太空培养7个月、12个月和18个月后取回样品。实验结果表明，在外太空环境下微生物分泌出很多类型的物质，例如蛋白质、多糖和有机酸等，它们能导致并加剧金属及高分子材料的腐蚀。他们通过电镜扫描观察了实验前后微生物内部结构的变化，结果发现对于细菌如枯草芽孢杆菌，实验后细胞结构不再完整—被分割成了很多段；对于真菌如杂色曲霉，实验后其外壁上形成了一层多糖，它正是在这层多糖的保护下才存活下来。同时仍有研究表明，细菌和真菌细胞在LDIR环境下能够自身快速修复受损DNA，改变碳源利用类型，并通过化学结果分析观察到细胞内的脂肪含量有所增加[6]。

因此本研究提出在LDIR环境中：①在微生物群落的演替早期，由于LDIR对不同种群产生了不同强度的生长时滞作用，从而在较短时间内有效地减弱了它们之间的相互竞争作用，使它们免于初期的竞争排斥。②初期各种群不同强度生长时滞很可能造成各个微生物种群数量呈现出不同相位的异步趋同波动，这将会在今后大大减小微生物群落内部的竞争作用，使微生物群落能够达到生物多样性平衡。选用太空中常见的优势微生物菌群，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及枯草芽孢杆菌进行培养，通过实验观测该群落为响应LDIR内部发生的变化，探究其中所包含的动力学机制，并于计算机仿真相结合，验证了上述假说，为科学认识LDIR环境下微生物群落的复杂演替过程，以及其中物种多样性的产生和维持机制奠定了理论基础。

1 材料和方法

1.1 特殊环境模拟培养箱

为了研究空间LDIR环境下，微生物群落物种多样性的产生和维持机制，北京航空航天大学环境生物学与生命保障技术研究所研发了能够模拟空间LDIR环境的“特殊环境模拟培养箱”（图1），采用X-射线发生器诱导箱内的空气发生电离，形成等离子体，在箱内的不同位置处放置6个培养皿，箱内微生物会接受到不同强度的电离辐射，培养基采用Luria-Bertani，温度为23°C，气压为100 kPa，相对湿度为30%～70%（与空间站环境一致）。

1.2 微生物短期培养后细胞形貌观察

1）目标菌株初期培养：分别取金黄葡萄球菌、大肠杆菌及枯草芽孢杆菌电离活化菌液和金黄葡萄球菌、大肠杆菌及枯草芽孢杆菌非电离活化菌液适量，以10%的浓度接种于含有EPDM基材的无机盐培养基中，分别置于“特殊环境模拟培养箱”（有LDIR）及ZWYR-D2401型微生物智能培养箱（无LDIR）中37 ℃、150 r/min培养条件下培养。

图1 特殊环境模拟培养箱及其内部结构示意图（其中①②③④⑤⑥为接种培养皿的位置）Fig.1 LDIR environment simulator and its 3D geometric configuration（where ①②③④⑤⑥ are the location of the petri dishes）

2）标准菌株固定：分别对1）中提到的各标准菌进行12 h及24 h培养液取样，各样品在1 500 r/min离心10 min，弃上清液，然后加入1%戊二醛固定液，固定50 min。不时摇动，使菌落细胞均匀分布于固定液中。

3）离心：细胞固定液经1 500 r/min离心10 min，弃上清液，使细胞与固定液分离。

4）漂洗：然后用0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗2次，离心，弃上清液。

5）涂片：用洁净的铂金环取菌落细胞，在小盖片上涂一薄层（涂2～3个样品，以免脱水过程中细胞流失），待固定后进行乙醇脱水。

6）脱水：用50%、70%、80%、90%、95%梯度的乙醇分别依次脱水，每次10 min，最后用无水乙醇脱水2次，每次10 min。

7）临界点干燥：将脱水后的样品转入中间液乙酸异戊脂中，置换乙醇。在临界点干燥器的样品室内，用液态二氧化碳置换乙酸异戊脂。在达到临界状态（31℃，72.3 atm）后，将温度升至40℃，使液态CO2完全气化，然后打开放气阀门，逐渐排出气体，使样品完全干燥。取出后，置于普通干燥器中。

8）电子显微镜观察：将干燥后的样品放入真空泵镀仪的玻璃罩内，使样品表面喷镀一层铂金属膜，然后置于JSM-6700F型扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）下观察各种微生物细胞外部形貌。

9）同时对2）中各样品采用FDA/PI微生物活死细胞染色，于激光共聚焦显微镜下观察各种微生物的荧光染色情况，对照7）所得SEM照片，确定微生物在初期培养过程中活细胞外部形貌的变化。

1.3 建模与仿真

由于微生物群落各物种之间的基本生态关系是竞争，因此种群变化的动力学机制应符合经典Lotka-Volterra竞争方程。本研究在此方程的基础上，将LDIR诱导产生的种群生长延迟时间引入其中，得到LDIR环境下微生物种群变化的动力学模型。在MatLab/Simulink平台上，把微生物群落演替的延迟微分方程动力学模型转变为仿真模型，进行大规模的计算机数值仿真实验，最终确定LIDR环境下，微生物群落中物种多样性的产生与维持机制[12-13]。

2 结果与讨论

2.1 短期LDIR环境下微生物细胞的形貌观察

利用SEM观察微生物细胞形态和表面超微形态结构的研究，按照常规方法对培养初期的单菌落细胞进行SEM观察前的处理。以实验标准菌株大肠杆菌为例，所得结果如图2所示。

图2 大肠杆菌初期培养细胞形貌SEM观察图Fig.2 E.coli morphological observation by SEM at earlier culture stage

图2中A、C、E依次为非LDIR条件下大肠杆菌初期培养0 h、12 h、24 h的细胞形貌，B、D、F依次为低剂量电离辐射条件下大肠杆菌初期培养0 h、12 h、24 h的细胞形貌。对比可以看出，大肠杆菌在非LDIR条件下，其菌株的细胞形貌经历了饱满圆润到部分褶皱，最后细胞部分裂解的变化过程，而在LDIR条件下同时期微生物的细胞体并没有发生裂解，只是保持着更严重的褶皱状态。A图是刚接种时的非LDIR下大肠杆菌活化菌株形貌，此时接种菌株处于活化对数生长期，其细胞表面光滑；C图是在正常环境（非LDIR）下经过12 h培养大肠杆菌的细胞形貌图，只有少数菌株形貌出现表面褶皱；E图是在正常环境下培养24 h下大肠杆菌的细胞形貌图，细胞表面的褶皱进一步加深，部分细胞甚至开始裂解死亡。相比而言，大肠杆菌在LDIR下，同一生长时期，其细胞形态与非LDIR下的有明显差别，12 h的初期培养后仅有部分细胞表面出现不明显得褶皱现象，而培养24 h后同样仅出现褶皱并未发现有裂解的现象。由此可见，LDIR对大肠杆菌的形貌产生明显影响。为了对细胞形貌状况进一步分析，选用两种细胞活性染色试剂二乙酸荧光素（Fluorescein Diacetate，FDA）和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）检测细胞活性。FDA/PI广泛应用于检测微生物细胞的活性。FDA能够进入菌体细胞，在细胞内非特异性脂酶催化作用下，本身不具有荧光的物质FDA生成荧光素，经480 nm激光激发出波长为530 nm左右绿色荧光，死细胞具有不完整的细胞膜，生成的荧光素易扩散，难以检测到绿色荧光的死细胞；PI难以进入具有完整细胞膜的活细胞，当菌体细胞细胞膜不完整时，进入细胞的PI与DNA结合，在488 nm激光激发下，可以检测到红色荧光。FDA/PI双染色方法是利用活死细胞经染色后会激发出不同波长的荧光特点来判断细胞活性的。以初期培养24 h的大肠杆菌样品为例，其FDA/PI双染色观察结果如图3所示。

图3是对初期培养24 h后的大肠杆菌样品进行FDA/PI双染色的结果，图A～C是非LDIR下大肠杆菌试样的染色结果，图D～F是在LDIR下大肠杆菌试样的染色结果。图A、D是FDA的染色结果，图B、E是PI染色结果，图C、F是FDA/PI双染色后叠加结果。从图3可以看出，初期培养约24 h的大肠杆菌试样，在无LDIR下绝大多数微生物个体处于死亡状态，而在电离辐射条件下大肠杆菌细胞个体没出现大量死亡，只有少数个体死亡。大肠杆菌细胞体的FDA/PI染色结果更直观地验证SEM结果，更有力地说明微生物个体为了适应LDIR的影响，其细胞表面出现褶皱且微生物个体保持活性状态，从实验上证实了LDIR使微生物在培养初期产生明显时滞效应的假设。

图3 初期培养24 h大肠杆菌样品的FDA/PI双染色Fig.3 Double staining of E.coli by FDA/PI at earlier culture stage of 24 h

2.2 微生物种群的延迟Lotka-Volterra竞争模型

经典的Lotka-Volterra竞争方程见式（1）可以有效描述不同种群由于对资源的竞争产生的生态关系，该生态关系决定了各种群数量的动态变化过程。

其中：xi表示第i种微生物在t时刻的数量；ri是它的内禀生长率；Ki是它的环境容量；αij表示第j种微生物对第i种微生物的竞争抑制系数。

然而在LDIR环境下，会对微生物群落中的各种群的某些个体产生程度不一的时滞作用，因此本研究提出2个基本假设：①处于生长时滞状态的微生物不再生长和分裂；②处于生长时滞状态的微生物也不需要消耗任何外部基质。因此式（1）可以改写成式（2）形式，作为LDIR下微生物种群数量变化的动力学模型

其中：λi表示第i种微生物种群内因LDIR作用产生了生长时滞的个体占总体的百分数；ωi和τi表示因LDIR导致的第i种微生物产生的时滞，其中ωi表示由自身因素（如在基质不足时利用体内的能量物质）导致的生殖时滞；τi表示LDIR导致的环境时滞，例如LDIR直接影响微生物内部的代谢或诱导产生抑制性的胞外分泌物，从而延迟微生物的生长等。

2.3 微生物种群多样性产生和维持机制检验的仿真实验

本研究选择10种微生物，在大量不同的α，r，K和x初始值下，对公式（1）进行数值仿真实验，得到的都是类似的结果（图4）。可以看出，只有少数种可以存活下来，其他的种被竞争排斥掉，微生物群落内部不可能达到物种多样性稳定。

图4 由于竞争排斥导致的微生物群落非多样性稳定Fig.4 Microbial community stability without species diversity due to competitive exclusion

如果让这些微生物种群之间不发生竞争淘汰，它们必须发生生态位分化，导致竞争系数αij减少，如不同微生物种群利用不同的基质生存，相互之间不发生对基质的竞争作用，这样基质的种类必须大于微生物的种类才可保证微生物食性变化的需求，然而这种情况在空间站环境里是不存在的。

由于LDIR环境诱导微生物群落各种群中的某些个体产生了生长时滞。这时种群竞争模型变成公式（2）的形式，与公式（1）相比，假如r，K，αij和x初值都保持不变。需要说明的是，由于微生物产生了适应性，因此公式（2）的等号右边第2项中的r，K等可能与第1项不同，但这里把它们取相同值，因为即使取不同的值也会呈现相同的规律。取不同的延迟时间—ωi和τi，假设延迟仅发生在第1世代，对公式（2）做仿真实验，得到大量类似图5的仿真实验结果。

图5 LDIR的时滞作用导致的微生物群落生物多样性稳定Fig.5 Microbial community stability with species diversity resulting from growth delay by LDIR

从图5中可以看出，由于LDIR的时滞作用，在微生物群落演替初期各种群免于了竞争排斥，此后种群数量形成了不同周期的异步趋同波动—不同微生物种群有不同的数量波动相位，相位之间存在差异，比如种群x2和x4，当x2处于高位时，x4处于低位，反之亦然。而它们之间竞争的强弱是由x2，x4决定的，因此它们之间波动的相位差有效地减小了它们之间的竞争强度，使它们有可能共存，并形成生物多样性稳定。

3 结 论

本研究首次提出了在LDIR环境下，能够使微生物群落中的各个物种发生不同程度的生长延迟，从而产生与维持微生物群落内部的物种多样性观点。通过实验观测确证了这种动力学机制的存在，并根据计算机数值仿真实验结果，证实了这种机制对产生和维持微生物群落内部物种多样性的有效性。从而为科学认识空间LDIR环境下微生物群落复杂多样性的演替过程奠定了理论基础。