持续有氧运动和高强度间歇运动对高血压大鼠骨骼肌代谢及纤维类型的影响

孙一 裴晶晶 李学恒

摘 要：目的：对比8周持续有氧运动和高强度间歇运动对高血压大鼠骨骼肌代谢及纤维类型的影响，为制定最佳运动康复处方提供理论依据。方法：30只自发性高血压大鼠随机分为安静对照组（SED）、持续有氧运动组（CAE）和高强度间歇运动组（HIE）。实验前后利用无创血压仪测定尾动脉血压，包括收缩压（SBP）和舒张压（DBP），实验后分离比目鱼肌（慢肌，I型肌纤维为主）和胫骨前肌（快肌，II型肌纤维为主），酶联免疫吸附法测定柠檬酸合酶（CS）活性，ATP酶染色法鉴定肌纤维类型（I、II）以及毛细血管密度，Western Blot法测定线粒体电子传递链复合体（CI、CII、CIII、CIV和CV），血管生成因子包括内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）蛋白相对表达量以及肌球蛋白重链（MHC）亚型（I、IIa、IIx和IIb）百分构成比。结果：1）血压水平：实验后CAE组SBP和DBP均较实验前显著性降低（P<0.05），HIE组血压水平无显著性变化（P>0.05）。2）比目鱼肌：CAE组和HIE组线粒体电子传递链复合体CII～CV以及SDH蛋白表达量显著性升高（P<0.05），CS活性均无显著性变化（P>0.05）;HIE组毛细血管密度以及eNOS和VEGFR2蛋白表达量显著性降低（P<0.05）、HIF-1α表达升高（P<0.05），CAE组毛细血管密度及各血管生成因子均无显著性变化（P>0.05）;CAE组和HIE组MHC IIa型比例增加（P<0.05），MHC IIx型比例减少（P<0.05）。3）胫骨前肌：CAE组和HIE组线粒体电子传递链复合体CI～CIII和CV蛋白表达量显著性升高（P<0.05），CS活性均显著性下降（P<0.05）;HIE组SDH蛋白表达量显著性降低（P<0.05），CAE组无显著性变化（P>0.05）;HIE组毛

细血管密度以及VEGF和VEGFR2蛋白表达量显著性降低（P<0.05）、HIF-1α表达升高（P<0.05），CAE组毛细血管密度显著性升高（P>0.05），但各血管生成因子均无显著性变化（P>0.05）;CAE组MHC IIb型比例减少（P<0.05），MHC IIx型比例增加（P<0.05），HIE组MHC IIb型比例增加（P<0.05）。结论：持续有氧运动和高强度间歇运动对自发性高血压大鼠骨骼肌代谢和纤维类型的影响存在显著差异，持续有氧运动是改善高血压骨骼肌氧化能力的适宜方式。

关键词：高强度间歇运动;持续有氧运动;高血压;骨骼肌;纤维类型;代谢

中图分类号：G804.2 文献标识码：A文章编号：1006-2076（2019）01-0064-09

高血压是心力衰竭以及心源性死亡的首要原因。高血压患者心肌功能紊乱（心脏泵血机能减弱），同时可造成骨骼肌代谢异常[1]。高血压的病理生理机制尚未完全明确，其中能量代谢异常在该疾病发生发展过程中起关键作用。动物模型研究证实[1]，高血压心肌和骨骼肌线粒体含量以及毛细血管数量减少，骨骼肌II型纤维（快肌）比例增加，氧化能力下降。由于骨骼肌纤维类型转换及代谢紊乱，患者常出现疲劳及运动不耐受，最终导致生活质量降低。调控肌纤维类型分布及代谢是改善高血压患者临床症状、提高运动能力和生存质量的策略之一。动物实验以及临床研究均证实[2]，运动是高血压患者非药物治疗的重要手段，然而改善骨骼肌氧化能力的最佳运动处方（运动方式及运动负荷）至今尚未确定。

运动能够诱导骨骼肌产生适应，例如一次急性运动即可激活多种调节代谢的转录因子，其中γ过氧化物酶体增殖物活化受体辅活化蛋白1 （peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1 alpha，PGC-1α）表达上调对线粒体生物合成起决定作用，而反复运动刺激（即长期规律运动）的累积效应引起线粒体含量增加，氧化酶活性提高和/或表达量上调，骨骼肌有氧代谢能力随之增强[3]。此外，运动尚能够改变肌纤维类型分布，促使I型肌纤维比例增加。对于健康者，高强度间歇运动（high-intensity interval exercise，HIE）和持续有氧运动（continuous aerobic exercise，CAE）均可诱导上述适应性反应，且两种运动方式间比较并无显著性差异，提示骨骼肌适应不存在运动强度依赖性[4]，因此相对于传统CAE模式，HIE具有省时、有效等突出特点。本课题组前期针对健康SD大鼠的研究证实[5]，一次急性HIE可同时募集快肌和慢肌纤维并激活多种信号转导通路，而长期（8周）HIE则提高快肌中I型和IIa型肌纤维以及慢肌中I型肌纤维比例，上调快肌和慢肌糖原含量和有氧代谢酶活性以及快肌无氧代谢酶活性，最终改善运动能力。然而HIE是否同样适用于临床患者特别是心功能处于代偿期的心血管疾病者（如高血压）尚缺乏有利证据。动物实验显示[6-9]，长时间剧烈运动或力竭运动可引起心脏适应不良，甚至发生心律失常以及心源性猝死。据此推测，病理状态下运动时应存在“强度阈”，超过该阈值易造成病理性适应。然而，Chicco等[10]针对高血压大鼠的研究发现，运动强度过低不足以诱导线粒体生物合成。因此，深入研究不同运动方式对高血压的疗效对于制定最佳运动康复方案具有重要意义。本研究目的在于对比HIE和CAE对自发性高血压大鼠骨骼肌纤维类型和代谢的影响。我们假设，HIE和CAE均可增加骨骼肌线粒体含量、促进肌纤维向耐疲劳的慢肌转换、改善毛细血管/肌纤维比例，最终提高骨骼肌氧化能力，从而证实HIE可作为高血壓患者省时、安全、有效的运动方式。

1 材料和方法

1.1 实验动物

30只自发性高血压大鼠，8周龄，购自军事医学科学院实验动物中心。12 h/12 h昼夜交替光照，自由进食水。将实验动物随机分为安静对照组（sedentary，SED），高强度间歇运动组（HIE）和持续有氧运动组（CAE）。

1.2 运动方案

所有动物适应环境1周后进行3 d适应性训练，方案为：速度10 m/min、坡度0°、时间10～15 min/d。随后测定大鼠最高跑速（maximal velocity，Vmax）[11]，方法为：起始负荷为5 m/min，坡度为0°，每2 min递增1.5 m/min，直至力竭（力竭标准：大鼠拒绝继续运动，在电刺激下仍停留在跑台后部）。

根据Borges等[12]和Hoydal等[13]的方法并稍加修改制定CAE和HIE组跑台运动方案。HIE组：以80%Vmax运动4 min、40%Vmax运动4 min，之后依次交替进行，重复7次（运动时间为56 min）;CAE组：以60%Vmax持续运动56 min。两种训练方式总的运动负荷相同，即HIE组：（80%×4+40%×4）×7=33.6 Vmax·min;CAE组：60%×56=33.6 Vmax·min，因此可排除因运动负荷不同造成的偏倚。两组运动频率均为4天/周，共8周，每周末重新测定Vmax以调整训练负荷。SED组在鼠笼内安静饲养8周。

1.3 动脉血压测定

分别于训练前以及末次训练后48 h，采用智能无创血压测试仪（BP-2010A）测量尾动脉血压，包括收缩压（systolic blood pressure，SBP）和舒张压（diastolic blood pressure，DBP）。

1.4 动物取材

血压测定后用戊巴比妥钠（100 mg/kg体重）麻醉动物，分离胫骨前肌（快肌，II型肌纤维）和比目鱼肌（慢肌，I型肌纤维），将组织分为两部分，一部分进行蛋白表达或活性測定，取材后用锡纸包裹迅速投入液氮中并转移至-80℃低温冰箱冻存，另一部分制作组织切片进行组织化学测定（肌纤维类型、毛细血管密度）。

1.5 Western blot检测蛋白表达量

将骨骼肌组织匀浆裂解，4℃、20 000 g离心30 min，用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。取10 μg蛋白样品经15% SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜。一抗4℃静置过夜，包括内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS，1∶1 000）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF，1∶2 000）、血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2，1∶5 000）、低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α，1∶2 000）以及线粒体电子传递链复合体（CI、CII、CIII、CIV和CV）抗体（1∶

1 000）。以1∶1 000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体（二抗）37℃孵育1 h，充分洗涤后，使用ECL发光显影，X线胶片压片曝光，扫描各条带的灰度值，β-actin（1∶10 000）为内参蛋白。相对表达量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.6 柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）活性测定

将骨骼肌用外科剪剪碎，按照每g骨骼肌加入10 mL匀浆缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、250 mmol/L蔗糖、pH值7.4）的比例混匀后匀浆30 s（5 000 rpm），取2 mL匀浆液待用。以牛血清白蛋白为标准，Bradford法测定蛋白浓度。利用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定骨骼肌匀浆液CS活性。

1.7 肌纤维类型和毛细血管密度测定

参照课题组前期建立的方法[5]，利用ATP酶染色法测定肌纤维类型。将骨骼肌标本置于4%的多聚甲醛缓冲液中固定4～8 h后，常规石蜡包埋、切片（5 μm）。进行碱预孵（pH 10.6）1～2 h。拍照后用图像分析软件（Simple PCI）分析肌纤维类型分布（即I型和II型肌纤维所占百分比）。在Ⅰ、Ⅱ型纤维混合区选取3～6个视野利用Simple PCI图像分析软件测量单位面积内毛细血管以及肌纤维数量，用单位面积内毛细血管数量与肌纤维数量比值（capillary/fiber，CF）作为毛细血管密度。

1.8 肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）亚型测定

用Western Blot法测定MHC亚型（方法同1.5）。成像扫描后，MHC呈现为四条清晰的条带，即I、IIa、IIx和IIb。用凝胶图像分析软件分析MHC各亚型灰度值并计算各条带所占百分比（%）。

1.9 统计学分析

所有数据用“均数±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析，若P值<0.05，则采用LSD法进行多重比较。统计学差异定为α=0.05。

2 结果

2.1 实验期间动物一般情况以及最终样本量

实验期间各组大鼠未出现体毛凌乱、掉毛、无光泽，精神异常以及大便性状改变等运动相关不良症状及过度疲劳状态。实验过程中，由于拒跑等原因共剔除2只大鼠，最终纳入统计的样本量为n=28，其中SED组（n=10）、CAE组（n=9）、HIE组（n=9）。

2.2 血压的变化

与实验前比较，实验后CAE组SBP和DBP均显著性降低（P<0.05），SED组和HIE组血压水平无显著性变化（P>0.05）。

2.3 线粒体含量的变化

比目鱼肌：与SED组比较，CAE组和HIE组线粒体电子传递链复合体CII～CV蛋白表达量显著性升高（P<0.05）;CS活性均无显著性变化（P>0.05）;SDH蛋白表达量均显著性升高（P<0.05）。胫骨前肌：与SED组比较，CAE组和HIE组线粒体电子传递链复合体CI～CIII和CV蛋白表达量显著性升高（P<0.05）;CS活性均显著性下降（P<0.05）;HIE组SDH蛋白表达量显著性降低（P<0.05），CAE组无显著性变化（P>0.05）。

2.4 毛细血管密度的变化

比目鱼肌：与SED组比较，HIE组CF显著性降低（P<0.05），CAE组无显著性变化（P>0.05）。胫骨前肌：与SED组比较，HIE组CF显著性降低（P<0.05），CAE组显著性升高（P>0.05）。

2.5 血管生成因子的变化

比目鱼肌：与SED组比较，CAE组各血管生成因子无显著性变化（P>0.05），HIE組eNOS和VEGFR2降低（P<0.05）、HIF-1α升高（P<0.05）。胫骨前肌：与SED组比较，CAE组各血管生成因子无显著性变化（P>0.05），HIE组VEGF和VEGFR2降低（P<0.05）、HIF-1α升高（P<0.05）。

2.6 肌纤维ATP酶染色与MHC亚型的变化

ATP酶染色结果显示，I型肌纤维呈深蓝色，II型肌纤维呈浅蓝色。MHC亚型的变化见表1、表2。比目鱼肌：与SED组比较，CAE组和HIE组MHC IIa型比例增加（P<0.05），MHC IIx型比例减少（P<0.05）（见表1）。胫骨前肌：与SED组比较，CAE组MHC IIb型比例减少（P<0.05），MHC IIx型比例增加（P<0.05），HIE组MHC IIb型比例增加（P<0.05）（见表2）。

3 讨论

本研究发现，自发性高血压大鼠进行CAE和HIE均可[JP+1]上调慢肌（比目鱼肌）线粒体电子传递链复合体和SDH蛋白表达量并促进骨骼肌纤维向抗疲劳类型转换（MHC IIa型比例增加、IIx型比例减少），同时HIE下调eNOS和VEGFR2并上调HIF-1α蛋白表达并降低毛细血管密度。在快肌（胫骨前肌）中，CAE和HIE均增加电子传递链复合体蛋白含量，此外CAE诱导骨骼肌纤维向抗疲劳类型转换（MHC IIb型比例减少，IIx型比例增加）并促进血管生成，但HIE却增加MHC IIb型肌纤维比例，下调VEGF和VEGFR2并上调HIF-1α蛋白表达并降低毛细血管密度。上述结果提示，与健康大鼠不同，CAE和HIE对高血压大鼠骨骼肌纤维类型和代谢的影响存在显著差异，进一步提示CAE可能是改善高血压大鼠骨骼肌氧化能力的适宜运动方式。

3.1 线粒体含量的变化

运动训练能够促进骨骼肌线粒体增殖。SDH和CS是线粒体内参与有氧代谢的关键酶，电子传递链复合体嵌合于线粒体内膜并呈组成性表达，其表达量与线粒体氧化能力和线粒体含量呈正相关。在本研究中， CAE组和HIE组比目鱼肌电子传递链复合体亚单位蛋白表达量均显著性增加，同时SDH上调，提示两种运动方式均可提高骨骼肌氧化能力。这与Shepherd等[14]和Scribbans等[15]针对健康受试者的研究结果一致，即CAE和HIE够诱导骨骼肌线粒体产生相似的生理适应。出乎意料的是，CAE组和HIE组比目鱼肌CS活性均无显著性变化，与Pereira等[16]的研究不同（CS活性上调），可能与研究对象、样本量、组织特异性、肌纤维类型以及测试方法等因素有关。

本研究还发现，CAT组和HIE组胫骨前肌CS活性下降，此外HIE组SDH表达下调，这一结果与针对健康大鼠的研究截然相反（本应升高）[17]，提示病理状态（如高血压）能够对运动诱导的骨骼肌适应产生复杂影响。此外，多项以高血压大鼠为实验模型的研究证实，运动后CS活性的变化可能升高、不变或降低。Jacobs等[18]的研究同样指出，运动诱导的线粒体功能改变可能与线粒体相关基因表达的变化并不一致。8周HIE后电子传递链复合体蛋白表达升高，这与前人针对大鼠高强度运动模型以及力竭运动模型得到的结果不同。吕梅等[19]的研究表明，一次性力竭性运动引起大鼠肝脏线粒体NADH-CoQ还原酶（即CI）活性下降，致使胞浆内大量NADH无法进入呼吸链而堆积，线粒体氧利用能力降低;李洁等[20]的研究发现，运动性疲劳时骨骼肌呼吸链CIII活性下降;研究结果存在分歧可能与动物模型、运动方案、运动强度、肌纤维类型等因素有关。鉴于本研究中CAE和HIE均上调线粒体电子传递链复合体蛋白含量，结合上述结果我们推测，高血压大鼠运动后快肌纤维中表征氧化能力的指标并非同步升高。

3.2 毛细血管密度及血管生成因子的变化

运动过程中，运动肌细胞内局部氧分压下降（处于低氧环境），低氧激活对缺氧敏感的转录因子HIF-1，后者作用于多个低氧反应基因的启动子并促进其表达，包括eNOS、VEGF等。eNOS催化精氨酸合成NO并介导血管舒张反应，VEGF则是血管生成的关键调控因子。血管增殖有利于缩短血管与组织细胞之间的弥散距离、扩大弥散面积，血管舒张能够增加局部组织血流量，以满足运动肌的代谢需求。HIF-1α能够抑制线粒体生物合成[21]，长期运动则可下调健康受试者HIF-1α表达量[22]。然而本研究却发现，HIE组比目鱼肌毛细血管密度下降，同时eNOS和VEGFR2表达下调而HIF-1α升高，CAE组毛细血管密度和血管生成因子均无显著性变化，HIF-1α上调提示HIE可造成骨骼肌处于缺氧状态。

本研究还发现，胫骨前肌中，CAE组毛细血管密度增加，HIE组则下降，进而促进HIF-1α表达上调，再次说明HIE诱导运动肌发生低氧反应。针对健康者/动物模型的研究证实，CAE和HIE均可增加骨骼肌毛细血管密度以及eNOS表达量[16]，而对于2型糖尿病大鼠，CAE上调慢肌纤维毛细血管密度而HIE则无此作用[23]，进一步提示CAE和HIE诱导的骨骼肌适应与机体的健康状况有关。

HIE对骨骼肌不良效应的机制尚不清楚，可能与氧化还原失衡有关。由于强度较高，HIE大鼠心输出量不能满足运动肌的需氧量，无氧代谢形成大量次黄嘌呤核苷酸（inosine monophosphate，IMP），后者可造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）过量产生[24]。研究表明，适量ROS参与机体诸多生理过程并抑制HIF-1α表达，而过量ROS则下调VEGFR2表达，影响VEGF介导的血管生成反应[24]，因此本研究中HIE组毛细血管密度下降。上述研究表明，运动介导的过量ROS对于本处于氧化应激状态（如高血压）的组织器官（如骨骼肌）将产生负面影响。

3.3 肌纤维类型转换

肌纤维根据形态、代谢和收缩特性可大致分为慢肌（I型）和快肌（II型）两大类。根据MHC亚型可分为I、IIa、IIb和IIx四型。骨骼肌可根据功能需求而发生表型适应性改变。研究发现，运动能够改变肌纤维类型分布，一般而言，耐力运动促进肌纤维向慢缩、抗疲劳亚型转换并按照IIb→IIx→IIa→I的顺序进行[25]。在本研究中，CAE组和HIE组比目鱼肌MHC IIa型比例增加，MHC IIx型比例减少，提示两种运动方式均促进慢肌纤维向抗疲劳类型转换。然而在胫骨前肌中，CAE组MHC IIb型比例减少、MHC IIx型比例增加，HIE组MHC IIb型比例增加，提示CAE诱导快肌纤维向慢缩、抗疲劳亚型转换，而HIE则促使肌纤维向快缩、易疲劳亚型转换。募集反应在肌纤维类型转换中具有重要作用，HIE可同时动员快肌和慢肌纤维并诱导两类肌纤维发生适应性变化，因此HIE在促进胫骨前肌纤维类型转换同时增加线粒体含量。然而与本研究结果不同，本课题组前期以健康大鼠为受试对象的研究则证实[5]，HIE提高胫骨前肌中I型和IIa型肌纤维比例，提示HIE促进快肌纤维向抗疲劳亚型转换，再次印证病理状态下运动诱导的骨骼肌适应与健康状态下存在显著差异。

4 结论

CAE和HIE对自发性高血压大鼠骨骼肌代谢和纤维类型的影响存在差异，CAE是改善高血压骨骼肌氧化能力的适宜方式，这一结论是否适用于以骨骼肌氧化能力受损为特征的其他疾病状态（如糖尿病、心梗等）仍需进一步验证。今后的研究应进一步对比CAE和HIE对各种慢性病患者骨骼肌功能影响的差异，以形成最佳运动康复方案。

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