超声前处理对获取猪皮抗氧化肽效果的影响

赵安琪，王兴华，谢 伟，张 芳，王晓晴，孟 缘

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

我国是世界上较大的猪肉生产和消费国，猪肉加工生产过程中产生的大量猪皮因消化率低、加工不便、清洗不易等不利因素难以应用于衣食领域，导致资源浪费、环境污染。因此，开发利用猪皮是我国利用猪皮下脚料的主要方向之一[1]。并且猪皮胶原蛋白水解产物中含有具有生物活性的肽，其作用包括降低胆固醇[2]、抗氧化[2-3]、促创伤愈合[4]、降血压[5-6]、抗菌[7]等。胶原蛋白活性肽主要通过体外消化胶原蛋白获得，其中酶解法优点最多，应用最广，而文献中报道的蛋白质酶解过程多采用碱性蛋白酶[8]，故本文所选用的单酶即为碱性蛋白酶。

然而，目前关于猪皮酶法提取的研究报道不少，但大多侧重于酶解条件工艺筛选的研究，对酶解前前处理的相关研究较少，且猪皮脂肪组织发达，油脂的脱除是一大难题[9]。超声波是频率大于20kHZ的声波，它是一种波动形式，同时又是一种能量形式，可用于影响、改变以至破坏媒质的状态、性质及结构[10]，作为一种能量形式，超声波可破坏组织细胞[11-14]，张玲[15]等研究表明，超声能有效提高猪皮脱脂率，据此猜想超声在猪皮酶解工艺中对其产物的抗氧化活性亦有改善，特立此题研究。

本研究以猪皮为原料，用Na2CO3对其进行脱脂后，利用单因素试验，以ABTS自由基清除率为指标，确定酶解提取胶原蛋白抗氧化肽的最佳时间、温度、PH和酶用量，在最佳条件下，研究超声前处理时间对酶解产物清除ABTS自由基效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪皮：市售；碱性蛋白酶：食品级，陕西森弗天然制品有限公司，酶活力≥10万U/g;10%盐酸溶液、10%氢氧化钠溶液、浓硫酸。试剂为分析纯，水为高纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

R1002旋转蒸发器：上海申顺生物科技有限公司；DV251C电子天平：OHAuS;AB135-S十万分之一型天平：瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司； PHS-3CPH计：上海雷磁仪器厂；PK-S24电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；电热炉；离心机；L3S紫外分光光度计 ：上海仪电分析仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 脱脂

将新鲜猪皮去毛，刮除表皮脂肪，水漂洗三次，将猪皮切成5mm×5mm方形小块，称取一定量的剪碎的猪皮置于圆底烧瓶中，取备用猪皮四份，每份约 50g，置于旋转蒸发瓶中，加8倍量[16]2%碳酸钠溶液，40℃脱脂(60r/min)4h，水洗至中性，得到脱脂猪皮。

1.3.2 酶解

单因素试验设计

参考敖冉[17]等对酶解工艺的优选研究，将猪皮酶解单因素实验的基本条件定为：底物浓度为6%，酶与底物浓度比2.5%，酶解pH值=8，酶解时间4h,酶解温度50℃。改变其中一个条件，固定其他条件以分析酶与底物浓度比、酶解PH、酶解时间、酶解温度对酶解效果的影响。各因素梯度分别为：酶与底物浓度比：2%、2.5%、3%、3.5%、4%；酶解pH：6、7、8、9、10；酶解时间：3h、3.5h、4h、4.5h、5h；酶解温度：40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。

1.3.2.1 酶与底物浓度比因素的研究

取脱脂猪皮，用10%的氢氧化钠调节pH值=8，在50 ℃、转速45～50 r/min、加入碱性蛋白酶,保温4 h的酶解条件下，考察加酶量分别为2%、2.5%、3%、3.5%、4%时酶解得到的产物对ABTS自由基的清除率。清除率结果图 1。

1.3.2.2 酶解pH值因素的研究

取脱脂猪皮，用10%的氢氧化钠调节pH值，在50 ℃、转速45～50 r/min、加入碱性蛋白酶量为2.5%,保温4 h的酶解条件下，考察酶解pH值分别为6、7、8、9、10时酶解得到的产物对ABTS自由基的清除率。清除率结果见图2。

1.3.2.3 酶解时间因素的研究

取脱脂猪皮，用10%的氢氧化钠调节pH值=8，在50 ℃、转速45～50 r/min、加入碱性蛋白酶量为2.5%的酶解条件下，考察酶解时间分别为3h、3.5h、4h、4.5h、5h时酶解得到的产物对ABTS自由基的清除率。清除率结果见图 3。

1.3.2.4 酶解温度因素的研究

取脱脂猪皮，用10%的氢氧化钠调节pH值=8，在转速45～50 r/min、加入碱性蛋白酶量为2.5%,保温4 h的酶解条件下，考察酶解温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃时酶解得到的产物对ABTS自由基的清除率。清除率结果见图 4。

在各单因素条件下酶解后，分别取出于电热炉上煮沸10min灭酶，冷却，4500r的转速离心5min，抽滤，上清液定容至250mL，取100mL于锥形瓶中，得5份待测溶液。

每个因素重复3次实验，结果取平均值。

1.3.3 超声前处理

对猪皮进行酶解前的超声处理，设置处理时间分别为0min、10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min。然后在碱性蛋白酶的最适条件(酶与底物浓度比2.5%，酶解温度50℃，pH值=8，酶解时间4h)下对超声处理的猪皮分别进行酶解，检测其酶解产物对ABTS自由基的清除率。

1.3.4 指标测定

1.3.4.1 ABTS自由基清除法原理

用 K2S2O8与 ABTS 直接生成稳定的阳离子自由基 ABTS+，抗氧化物质与ABTS+发生反应而使反应体系褪色。

1.3.4.2 ABTS工作液的制备

ABTS储备液(7.4 mmol/L)的制备：取ABTS 96 mg，加蒸馏水25 mL。

K2S2O8储备液(2.6 mmol/L)的制备：取K2S2O8378.4 mg，加蒸馏水10 mL。

将5 mL 7.4 mmol/L ABTS储备液与88 μL 2.6 mmoL/L K2S2O8混匀，静置12～16h，配制成ABTS工作液。

1.3.4.3 PBS缓冲液的制备

称取氯化钠7.9g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.8g，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容到1L。保存于4℃冰箱中。

1.3.4.4 ABTS+自由基清除率测定

取0.4 mL ABTS工作液，用pH值为7.4的 PBS 溶液稀释，要求用紫外分光光度计测得其在常温下734nm 处吸光值为 0.7±0.02。取稀释后的ABTS+·工作液0.2 mL 与 10μL 不同条件受试物混合，常温避光静置 6min，在 734 nm 波长处测吸光度，平行3次。

ABTS自由基清除能力由下式计算：

清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100%

式中： A0为不加样品，加入 ABTS 的吸光度；Ai为加入样品和 ABTS 的吸光度。

2 结果与分析

2.1 碱性蛋白酶酶解猪皮单因素优化实验结果

2.1.1 酶与底物浓度比对清除率的影响

由图 1可知，酶与底物浓度比为2.5%时，清除率最高达88%左右，随着酶与底物浓度比的进一步增加，清除率总体呈缓慢下降趋势，综合考虑清除率和经济因素，酶与底物浓度比以2.5%左右为宜。

图1 碱性蛋白酶在不同酶浓度时的酶解产物对ABTS自由基的清除率

2.1.2 酶解pH值对清除率的影响

由图2可知，碱性蛋白酶酶解猪皮存在最适pH值=8，此时清除率最高达81%左右。

图2 碱性蛋白酶在不同酶解PH时的酶解产物对ABTS自由基的清除率

2.1.3 酶解时间对清除率的影响

由图3可知，碱性蛋白酶在酶解时间为4h时，清除率达到最大值后开始趋于平缓，继续加热意义不大，此时的清除率是83%。

图3 碱性蛋白酶在不同酶解时间时的酶解产物对ABTS自由基的清除率

2.1.4 酶解温度对清除率的影响

由图4可知，性蛋白酶在酶解温度为50℃时清除率最大为82.4%，继续升温清除率值呈直线下降。

图4 碱性蛋白酶在不同酶解温度时的酶解产物对ABTS自由基的清除率

2.2 超声预处理时间对清除率的影响

由图5可知，超声预处理猪皮可整体提高清除率，并且超声50min时清除效果最好，清除率为88.9%。

图5 碱性蛋白酶在不同超声预处理时间时的酶解产物对ABTS自由基的清除率

3 结论

碱性蛋白酶水解猪皮的产物具有抗氧化性，碱性蛋白酶酶解猪皮的最适条件：酶与底物浓度比2.5%、酶解pH值=8、酶解时间4h、酶解温度50℃，此时ABTS+·清除率79.8%。这与余霞[18]等、张荣华[19]等人的研究结果相一致。

超声预处理对猪皮的酶解效果明显优于未超声的效果。其中超声时间为50min时酶解效果最好，其自由基清除率可达88.9%。