超重/肥胖人群生物样本库的建立及管理

王晖 李晓东 吴辉坤 任朦 梁海莉 汪婷 陶军秀

肥胖是由于能量摄入与能量消耗失衡所导致的体内脂质过多堆积，是当今全球普遍性的公共健康问题[1]。随着生活水平的提高，超重/肥胖人群的发病率越来越高[2]，肥胖与多种慢性非传染性疾病的发生密切相关[3-6]，控制超重/肥胖的发病率是全球普遍关注的问题。课题组与华中科技大学同济医学院公共卫生学院合作项目“中医体质辨识与肥胖人群相关性研究”，对1451例超重/肥胖人群进行筛查体检，并建立了具有中医特色的超重/肥胖人群生物样本库。生物样本库，又称生物银行（biobank），主要是指标准化收集、处理、储存和应用健康与疾病生物体的生物大分子、细胞、组织和器官等样本，包括人体器官、全血及血液成分（血浆、血清、白细胞、红细胞等）、核酸（DNA、RNA）、生物体液以及与这些样本相关的临床、病理、治疗、随访、知情同意等资料及其质量控制、信息管理与应用系统[7]。生物样本库建设是临床医学研究的基石[8]。

1 材料与方法

1.1 研究对象

通过招募方式招募于2016年10—11月在湖北省中医院肝病研究型门诊进行体检的志愿者。纳入标准：（1）居住在武汉市的居民；（2）年龄在20～59岁之间；（3）BMI≥24 kg/m2的人群；（4）自愿签署样本捐献知情同意书。排除标准：（1）器质性心脏病或心律失常者；（2）肝肾功能不正常者；（3）妊娠试验阳性或哺乳期妇女；（4）过敏体质者。本生物样本库通过了湖北省中医院伦理委员审查，所有研究对象均签署了知情同意书。

1.2 仪器设备

-80 °超低温冰箱（panasonic MDF-U7386S，Haier DW-86L626），医用冰箱（BIOBASE，BDF-25V27ORF），离心机（cence TDZ5-WS），美国BRADY（贝迪）标签打印机和低温标签。

1.3 研究方法

由专业招募受试者公司通过社区居委会发放超重/肥胖体检通知及体检条件，预约符合超重/肥胖体检要求的受检者按预约日期分时段（7：30和9：00）到达检测现场。

1.3.1 基本信息的采集 清晨空腹状态下使用统一校正过的器械按标准流程测量受检者身高、体质量、腰围、臀围，计算身体质量指数（BMI），计算公式：BMI=体质量（kg）/身高2（m2），BMI≥24 kg/m2的受检者，统一由同济公共卫生学院教授指导在读研究生/博士生进行问卷调查。问卷内容包括一般个人情况、居住生活条件、职业史、患病史和家族疾病病史、用药史、生活方式评估、听力相关症状评估、过敏与咳嗽咳痰、耳鸣和眩晕等情况、女性健康评估等。

1.3.2 样本的采集与保存 样本采集流程图见图1。嘱受检者禁食12 h，晨起在检测现场空腹抽肘静脉血并留取晨尿2管，10 mL/管（女性月经期除外），由3名受过专业训练的护士采集每位受检者全血样本10 mL（普通管3mL一管；带分离胶管3mL一管；EDTA抗凝管2管，2 mL/管）。其中普通管送生化室检测生化指标，EDTA抗凝管1管送临床室检测血常规；其余2管由生物样本库3名专职人员离心分装，血样本静置1～2 h离心，带分离胶管3 500 r/min 离心 10 min，分装冻存管 2 管（0.5 mL/管）；EDTA 抗凝管 3 500 r/min 离心 5 min，取血浆 0.5 mL 一管，红细胞 2 管（0.5 mL/管）；血样本于样本采集8 h内完成分装并存入-80°冰箱。尿样本送检验科1管查尿常规，一管于采集1 h内2 500 r/min离心10 min，分装3管，2 mL/管；尿样本于样本采集2 h内完成分装并存入-80°冰箱。所有样本均在生物安全柜中分装，并通过冻存管条码上的项目ID与样本采集管上标记的ID对应。

图1 样本采集流程图

1.3.3 检测项目 （1）基本体检：血压、心肺听诊、心电图、腹部B超；（2）生化指标：由检验科专业技师集中测定ALT、AST、GGT、ALP、TBIL、DBIL、ALB、BUN、CR、GLS、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、血常规、尿常规、粪常规；（3）中医体质辨识（上海道生医疗科技有限公司，DS01-A）、中医舌诊图像处理专家系统（北京普利生仪器有限公司，TID-2000）、肝脏硬度无创检测（深圳市一体医疗科技有限公司HEpatest，ET-CD-Ⅱ）和人体成分分析（韩国 Biospace Co.，Ltd，InBody 770）。

1.4 生物样本库的信息化管理

（1）编码规则： 规律的编码便于样本查询，本课题样本编码规则：年+TJ+流水号+样本类型+分管号（样本类型以英文字母代替），每份样本均设置2个瓶签，冻存管盖上小园标签标记“二维码+项目ID”；瓶身长型标签显示：样本编码规则内容+项目类型+二维码+项目ID+采样日期；（2）样本信息预录入：根据预约人数，提前一天按编码规则进行样本信息预录入，打印样本条码，平整黏贴在冻存管上，黏贴好条码的冻存管按规律摆放整齐备用。（3）生物样本相关数据的信息化管理：使用上海万格科学器材有限公司的样本库冻存管理软件，美国BRADY（贝迪）标签打印机和低温标签，对样本实行条码扫描存储，对样本捐献者的基本信息、检测结果、问卷内容和样本信息进行规范化的录入，使存储的每一份样本都对应着详细的临床病历信息。（4）生物样本信息安全管理：尊重样本捐献者隐私，样本只涉及编码，不涉及样本的个体信息。个体信息是科学研究的重要组成部分，信息安全尤其重要，工作人员现场采集的受检者信息和数据由专人维护管理，并对访问数据库人员设置权限，生物样本信息和受检者信息分属不同权限人员管理，所有计算机均设置密码口令。

2 结果

2.1 样本收集情况

共 纳 入 24 kg/m2≤ BMI＜ 28 kg/m2的 超 重 病 例 725 人，BMI≥28 kg/m2的肥胖病例726人，共计1 451例，男597例，女854例，平均年龄26.79岁，年龄区间分布见图2，中医体质分布见表1。共收集样本11 530份，其中血清2 902份，全血1 451份、红细胞2 902份，血浆1 451份，尿4 176份，粪99份。

图2 超重/肥胖病例年龄区间分布（1人未填写年龄）

2.2 样本质量控制

表1 超重/肥胖病例中医体质分布（1人未填写年龄）

从现存样本中随机抽取保存期半年的样本，由第三方实验室（深圳承启生物科技有限公司）提取RNA，RNA提取方法：250 μL 血清中加入 1 mL Trizol吹打裂解，室温静置 5 min；加200 μL 氯仿，剧烈振荡 30 s，静置 10 min；4℃，12 000 g 离心10 min，吸取上清400 μL，加入400 μL异丙醇，混匀，静置10 min；4℃，12 000 g 离心 10 min，去上清，加入 1 mL 75% 乙醇；4℃，12 000 g离心10 min，重复上一步；去酒精，晾干，加入20 μL dd水溶解。送检的79份样本，有77份样本首次抽提RNA浓度高于15 ng/μl，成功率为97.47%，达到建库测序标准。后续质控显示所提取RNA完整性良好，满足相关科研实验需求。

3 讨论

我国超重和肥胖人口数量逐年增加，带来巨大的健康风险，同时慢病的发病率与日俱增，已经成为危害我国国民健康的头号威胁[9]。2010年的研究显示，我国成人超重率一直以每年3%的速度上升，肥胖以每年6%以上的速度上升，肥胖增长速度高于当时世界平均水平，2012年我国成人超重率为30.1%，肥胖率为11.9%[10]。随着肥胖率的升高，人们对超重/肥胖的关注和研究也越来越多，现有的研究表明，肥胖是导致胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、高血压、高血脂、脂肪肝以及癌症的危险因素之一[3-6，11]。因此，探索寻找有效的控制超重/肥胖的发病率成为研究人员工作的重点。近年来随着人类基因组计划的完成，研究人员认为，现代肥胖者增多与个体的遗传易感性有关，肥胖的发病是多因素综合作用的结果，其中起决定性作用的是遗传因素[12]。

人体生物样本库在国外已有多年的历史，我国正常与疾病生物样本库建设尚处于初期阶段，普遍存在条块分割、相互封闭，收集不规范，缺乏统一标准化流程、质控体系、安全保障体系与信息化管理系统等问题[13]，最早的生物样本库是于1994年中国科学院建立的中华民族永生细胞库[14]，目前针对超重/肥胖人群的生物样本库建设较少见。我院建立的具有中国特色的采集了中医体质、舌像的超重/肥胖生物样本库，为超重/肥胖的基础和临床研究奠定了基础，为后续研究其发生发展、变化趋势和治疗提供高质量的样本资源，全面分析肥胖的遗传变异因素，与中医体质结合，对制定超重/肥胖的预防和控制措施，改善人民健康，促进全国中医院资源流通与共享，为中医药走出国门贡献力量[15]。