氯化锂对小鼠脑组织内总一氧化氮合酶的影响

徐海明 李红梅 李丽萍 李宏辉 刘贺荣 张鹏举 汪岭 德小明

卫生毒理学是研究物理、化学和生物因素对机体的损害作用、生物学机制、危险度评价和危险度管理的科学，是现代医学尤其是公共卫生预防医学专业中一门重要的基础课程。毒理学实践技能与基础理论对于高素质、创新性预防医学专业人才的培养具有同等重要的地位。现有的毒理学实验教育模式较难满足“大预防”背景下社会对预防医学人才的能力要求[1-3]。锂盐在临床、工业、国防等领域应用广泛。近年来，关于锂毒性反应的研究日益增多。研究表明，一氧化氮（NO）参与脑内许多生理过程，生理浓度的NO对学习记忆有促进作用，高浓度的NO则有一定的神经毒性。一氧化氮合酶（NOS）作为生成NO的唯一酶类，与脑发育及学习记忆等关系密切[4-6]。本实验旨在研究急性给锂对小鼠脑组织中总一氧化氮合酶（T-NOS）活性的影响，以期为进一步探讨锂的神经毒性及其机制提供科学参考，同时为卫生毒理学实验改革提供一个范例。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选用遗传背景明确、健康的SPF级ICR小鼠20只（体质量18～25 g，雄性，购于宁夏医科大学实验动物中心）。将实验动物在实验室环境中[昼夜节律为12 h/12 h，温度为（20±2）℃]自由饮水进食适应性喂养3 d。

1.2 主要试剂

氯化锂（LiCl，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）、总一氧化氮合成酶（T-NOS）测试盒（A014-2-1，南京建成生物工程研究所）。

1.3 研究方法

实验前，对实验动物进行编号，采用随机数字表法将实验动物分为4组，分别为溶剂对照组、低浓度组（1 mmol/kg体质量）、中浓度组（3 mmol/kg体质量）、高浓度组（10 mmol/kg体质量），每组5只。采用腹腔注射染毒方式，所有实验动物的腹腔注射体积均一致，对照组腹腔注射与染毒组等体积的生理盐水（LiCl溶液的溶剂）。

1.4 评价方法

染毒1 h后，用脱颈法处死小鼠。在冰盘上快速取脑，准确称重，使用4℃预冷的生理盐水漂洗。用眼科剪快速剪碎组织块，随后转移至加有预冷生理盐水的玻璃匀浆器中（组织与生理盐水的质量体积比为 1：9）。低温高速离心（4℃，10 000 g，20 min）后取上清液备检。严格按照总一氧化氮合成酶（T-NOS）试剂盒的步骤操作，其活性单位以每克组织每分钟产生的NO量（nmol）表示。

1.5 统计学方法

所有数据用（均数±标准差）表示，并采用SPSS23.0对数据进行统计分析。方差齐性时，使用单因素方差分析（oneway ANOVA）及LSD检验方法进行统计分析；方差不齐时，使用Games-Howell检验方法进行统计分析。

2 结果

如图1所示，与对照组相比，高浓度氯化锂染毒组小鼠脑组织内T-NOS活性差异具有统计学意义（P＜0.05）。与低浓度氯化锂染毒组相比，高浓度氯化锂染毒组小鼠脑组织内T-NOS活性差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 急性给锂对小鼠脑组织中总一氧化氮合酶（T-NOS）活力的影响（Mean±SD）

3 讨论

笔者长期从事卫生毒理学的理论和实验教学工作。在教研工作实践中，深刻体会到现有的毒理学实验教育模式较难满足“大预防”背景下社会对预防医学人才的能力要求。基于此，笔者对卫生毒理学实验教学改革进行了探索，提出了一套较为实用的实验教学选题方案（图2）。

神经毒理学是神经系统毒理学的简称，是研究外源化合物对神经系统引起的结构和功能损害作用的一门学科，是卫生毒理学学科体系的重要组成部分。笔者对常见神经毒理学研究方法进行了梳理（表1）。在《毒理学实验方法与技术》一书中，神经毒理学生理学方法一节中涉及到的是HPLC-RE-ECD法测定经典神经递质乙酰胆碱[7]。具体到神经毒理学范畴，乙酰胆碱与诸多神经毒物（如有机磷农药、氨基甲酸酯类杀虫剂、肉毒毒素等）的致毒作用密切相关。现实情况是，笔者所在单位的职业卫生实验课程中已经涵盖了乙酰胆碱的特异性蛋白水解酶-乙酰胆碱酯酶的测定。那么，其他神经递质（或神经递质相关）的测定实验是否适用于预防医学专业《卫生毒理学》实验课程的教学呢？

图2 高教卫生毒理学实验教学选题方案

作为一种信号转导分子，NO在许多生理和病理过程中（如调节生理性自稳态、细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等）扮演着重要的角色。鉴于其发挥作用的特殊性，科学界对NO神经递质属性的认知经历了一个颇为漫长的过程。在中枢神经系统内，NO既是神经递质，又是神经信使分子，在神经系统信息传递和发育中发挥着重要作用。在正常生理状态下，NO参与神经网络的构建和长时程的诱导和维持等过程，在学习过程中起重要作用[8]。但是，在应激状态下，NO以神经毒性作用为主（在《卫生毒理学》一书的神经和行为毒理学章节中，多次涉及到NO）。

NOS是体内催化左旋精氨酸生成NO的唯一酶类，广泛存在于中枢神经系统内。NOS有三种亚型，分别为神经源型（nNOS）、内皮源型（eNOS）和诱导型（iNOS）。如上所述，NO作为细胞内信使参与长时程增强的诱导和形成，NOS可通过NO影响学习记忆过程[6]。

在临床领域，锂剂作为治疗双相情感障碍的主要药物已有100多年的历史。大量研究证明，锂盐用于治疗急性躁狂以及预防双相情感障碍的反复发作有效。近半个多世纪以来，锂在冶金、国防等尖端工业上应用与日俱增，锂作为一种职业有害因素对特定作业环境中职业人群健康的影响逐渐引起人们的关注。职业性锂及其化合物的健康影响以局部刺激为主，其次为经呼吸道进入人体后引起的神经系统、肾脏、甲状腺等慢性损伤，最终导致慢性锂中毒。具体到神经系统损伤而言，锂对离子转运、动作电位的产生、神经递质调节的突触传递等神经元功能都有一定影响[9-12]。

表1 常见神经毒理学研究方法[7]

综上，选定了以“氯化锂对小鼠脑组织内总一氧化氮合酶（T-NOS）活性的影响”为题。关于染毒时间，预实验结果表明，腹腔注射氯化锂后，小鼠大脑皮层NOS活性的增强表现出一定的时程关系。具体地说，给锂后即刻小鼠大脑皮层NOS活性即增强，1 h达到高峰。随时程推移，因血锂浓度有所降低，NOS活性也表现出降低趋势。以此为参照，同时考虑到教学学时实际情况，本研究选定的染毒时间为1 h。

本研究结果表明，急性高浓度给锂后 1 h（10 mmol /kg体质量），小鼠脑组织内T-NOS活性显著增强。这一结果提示我们，急性给锂可使NOS活性应激性增强，进而诱导生成过多的NO，对神经系统造成一定的损害。当然，氯化锂调控中枢神经系统内NOS活性的具体机制有待进一步深入研究。

综上所述，“氯化锂对小鼠脑组织内总一氧化氮合酶（T-NOS）活性的影响”实验体现了笔者所述“高教卫生毒理学实验教学选题方案”的“相关性（与大纲高度相关）”“综合性（课程交叉性）”和“其他因素（如3R原则）”，是一个较为理想的预防医学专业卫生毒理学实验。