细胞传代对SD大鼠骨髓间充质干细胞衰老的影响

黄玉圣 吕辰菲 庄景燊 徐平 涂晨 吴迪峥 钟招明

(南方医科大学南方医院 1脊柱骨科，广东 广州 510515；2神经内科)

间充质干细胞(MSCs)是一类多能干细胞，主要存在于结缔组织和组织器官中，如骨、软骨、脂肪、内皮、肌肉和神经组织等，以骨髓组织中含量最为丰富，占骨髓细胞总数的0.001%～0.100%〔1〕。骨髓MSCs(BMSCs)具有自我复制能力和向成骨、成脂、成软骨等多向分化能力，可参与骨形成与骨吸收的动态平衡过程，维持组织和器官的内环境稳态及修复组织损伤等方面。衰老是生物界的普遍现象，BMSCs也可发生衰老变化。衰老的BMSCs不但形态上会发生变化，其增殖和多向分化能力也会发生不同程度的改变〔2〕。BMSCs的体外培养是其功能研究的重要途径。有研究表明体外培养的细胞会随着传代次数的增加而衰老，甚至丧失其特有的功能〔3,4〕。本实验拟通过体外分离培养大鼠BMSCs，探讨传代次数对BMSCs衰老的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 3～4周龄的SD雄性大鼠，由南方医科大学动物实验中心提供。动物许可证号：SCXK(粤)2016-0041，实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.2主要试剂与器械 胎牛血清(FBS，Sigma)，CO2培养箱(Thermo Fisher 公司)，青-链霉素(PanEra Life Science)，0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA，PanEra LifeScience)，MEM/F12(Hyclone公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)，水平离心机(上海德洋意邦仪器有限公司)，超净工作台(广州瑞智科学仪器有限公司)，SpectraMax M5多功能酶标仪(MDS公司)，倒置显微镜(德国Leica仪器股份有限公司，DM IL LED),电泳槽、转膜仪(Bio-RAD),化学发光仪(Tanon),细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Beyotime),CCK-8试剂盒(Beyotime),兔抗大鼠单克隆抗体P53、P21(Abcam),大鼠Ig G二抗(Proteintech)。

1.3实验方法

1.3.1SD大鼠BMSCs的原代分离与培养 3～4周龄SD雄性大鼠脱颈处死，体积分数为75%酒精浸泡 5 min，无菌条件下取出大鼠双侧股骨和胫骨，浸泡于装有75%酒精的10 ml离心管中，带入超净台中，用高温消毒后的器械剔除肌肉和贴附骨面的纤维结缔组织，剪开股骨和胫骨的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5 ml无菌注射器抽取PBS(含青-链霉素100 U/ml)，反复柔冲骨髓腔 3～5次,直至骨髓腔呈白色。70 mm筛网过滤后，收集过滤液以800 r/min离心3 min，弃上清，加入红细胞裂解液，吹打混匀，冰上裂解3 min后，800 r/min 离心3 min，弃上清，按1×109/ml密度接种至100 mm的培养皿，置于37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3.2BMSCs 的纯化与扩增 原代培养48 h半量换液，72 h后全量换液，全量更换培养基(不冲洗)，可将其中未贴壁细胞去除，以后每3 d全量更换新鲜培养基，PBS冲洗两遍。待细胞铺满培养皿底，密度达80%融合时，用0.02%EDTA+ 0.25%胰酶消化，消化时间约2 min,加入全培终止消化，800 r/min 离心3 min，弃上清，用含10%胎牛血清的 MEM/F12培养基重悬细胞后，1∶2的比例进行传代培养。重复上述步骤进行 P2～9代的传代培养。

1.3.3BMSCs 的形态学观察 取各代细胞，每日用倒置相差显微镜观察其生长形态及特征并拍照记录。

1.3.4BMSCs表面标志物的鉴定 取第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化，收集细胞于5 ml离心管中，800 r/min离心3 min，除上清，PBS重悬，调整细胞密度为1×106个/L，取流式细胞仪专用试管4个，每管加入300 μl细胞悬液，加入荧光抗体CD29 FITC、CD45 PE-Cy5.5、CD90 PE及同型对照抗体各5 μl，孵育15 min，采用BDFACSEALIBUR流式细胞仪进行测定。

1.3.5BMSCs 细胞周期检测 取生长良好的P3 BMSCs，先收集培养液备用，用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，洗下的细胞也需收集，胰酶消化，加入收集的细胞培养液终止消化，以800 r/min离心 3 min富集细胞，弃上清，PBS洗涤细胞一次(2 000 r/min,5 min),收集并调整细胞浓度为1.0×106/ml,取1 ml细胞悬液，以800 r/min离心3 min富集细胞，弃上清，在细胞中加入体积分数为70%冷乙醇500 μl重悬，吹匀细胞，4℃过夜。次日离心收集细胞，再以1 ml PBS洗涤1次，除去固定液，1 000 r/min离心3 min，加入100 μl RNase A,37℃水浴30 min,再加入400 μl碘化丙啶(PI)，4℃避光孵育30 min，离心弃上清，200 μl PBS 重悬后,流式细胞仪上机检测。

1.3.6BMSCs生长曲线的绘制 取P1、P3、P5、P7和P9代细胞，胰酶消化重悬后计数，以1×104个/孔接种于96孔板，分为8组，每组6个复孔，于第1～7天同一时间作相同检测，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱孵育2 h后，用酶联免疫检测仪于450 nm波长下检测吸光度值。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.3.7细胞衰老β-半乳糖苷酶染色 细胞传代，分别取P1、P3、P5、P7和P9代细胞，PBS洗3次，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min,PBS洗3次，加上新配制的SA-β-gal 染色工作液，保鲜膜封口，37℃(无CO2)孵育过夜，PBS液清洗3次后，倒置显微镜下观察并拍照。

1.3.8免疫印迹检测 加入RIPA 细胞裂解液静置5 min，超声破碎仪裂解1 min，4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜电转，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，条带加入兔抗大鼠P53和P21单克隆抗体(1∶1 000)，选取37 kD GAPDH作为内参，4℃ 20 r/min孵育过夜，TBST洗膜10 min x 3次，加入 HRP 标记的大鼠IgG二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，化学发光，采用Image J计算目标各带灰度值。

1.4统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t及χ2检验。

2 结 果

2.1SD大鼠BMSCs鉴定 流式细胞仪检测结果示，培养的P3 BMSCs均一表达CD29及CD90，阳性率分别为97.72%，98.23%;而CD45，呈阴性，阳性率为1.52%。

2.2BMSCs 细胞周期 流式细胞仪检测P3 BMSCs细胞周期，细胞100%为二倍体，其中G0/G1期87.37%，G2/M期4.06%，S期8.57%，提示绝大部分细胞处于静止休眠期，符合干细胞周期特征。

2.3不同代数细胞生长情况 分别对P1、P3、P5、P7和P9代细胞进行1～7 d连续培养测定发现，传代后1～2 d处于潜伏期，细胞增长不明显，3～5 d进入指数増长期，6 d后细胞增殖速度便有所减缓，进入平台期，增殖基本停滞，生长曲线见图1。从结果可发现P3～P5代的细胞增殖状况更良好。

图1 CCK-8检测不同代数BMSCs 1～7 d的增殖能力

2.4不同代数细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率 对不同代数的细胞行β-半乳糖苷酶染色，红色箭头标注的着深蓝色的细胞即为衰老细胞(图2)。随之进行β-半乳糖苷酶染色阳性细胞计数，其中P7(52.67%±7.93%)和P9(83.67%±3.27%)相较于P1(3.67%±1.25%)、P3(8.33%±3.11%)和P5(20.00%±5.35%)，SA-β-gal阳性细胞比例明显增高(图2)。

2.5不同代数细胞P53和P21表达变化 随着传代次数的增加，衰老相关蛋白P53和P21的蛋白水平表达量也逐渐增高，Western印迹结果示：P53和P21在P9代的蛋白相对表达量分别为3.43±0.66和3.31±0.28，明显高于P1代，见图3，表1。

图2 倒置相差显微镜下观察β-半乳糖苷酶染色阳性细胞(×100)

图3 细胞传代对衰老相关蛋白P53和P21表达的影响

组别P53蛋白P21蛋白P11.00±0.001.00±0.00P31.60±0.111.15±0.07P52.41±0.361.81±0.18P72.86±0.902.79±0.04P93.43±0.661)3.31±0.281)

与P1代比较:1)P<0.05

3 讨 论

BMSCs是骨髓基质中的非造血系成体干细胞，具有多向分化潜能，现已成为医学研究的热点。虽然BMSCs 没有公认的独特的抗原表型，但其培养过程可表达细胞CD表型〔5,6〕。本实验培养的BMSCs 均一表达CD29,CD90，阳性率分别为97.72%，98.23%，均大于95.00%;而CD45，呈阴性，阳性率为1.52%，小于5.00%，符合文献报道MSCs表面抗原的表达〔7〕。前期研究表明干细胞大部分细胞处于静止休眠期，此实验的细胞周期检测结果发现G0/G1期占88.37%，符合干细胞周期特征。

骨髓细胞成分复杂，造血干细胞是骨髓中含量最丰富的细胞，而MSCs 仅占骨髓细胞的 0.001%～0.01%〔8〕。由于BMSCs在骨髓中丰度低、分选难、分离细胞活性弱、纯度低、生物学活性易改变等缺点,严重限制了BMSCs的应用。本实验采用全骨髓贴壁法体外培养BMSCs，具有操作简便、效果可靠、对细胞活性影响较小等优点〔9,10〕。

细胞增殖能力下降是机体衰老的重要影响因素。既往研究发现，年轻小鼠中获取的MSCs的数量、细胞增殖能力明显优于老龄小鼠MSCs〔11,12〕。MSCs发生衰老时，影响其分化潜能，成脂能力增加而成骨分化能力下降〔13～15〕。本研究证实随着体外细胞传代次数增加，可导致MSCs增殖能力的改变，从而发生复制性衰老。

体外培养细胞在pH为6时，其β-半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而增加，这种中性β-半乳糖苷酶被定义为衰老相关的β-半乳糖苷酶。衰老细胞产生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X-Gal,生成深蓝色产物,被作为衰老细胞的生物标记〔16,17〕。研究表明衰老BMSCs细胞核膜内折，核染色质浓缩，线粒体数量减少，内质网扩张，体积增大或肿胀，并且高度表达β-半乳糖苷酶〔18〕。本研究证实随着体外细胞传代次数增加，β-半乳糖苷酶染色阳性率细胞增加。

细胞衰老与基因调控密切相关。研究发现具有细胞增殖调控功能的衰老相关基因包括抑癌基因P53、P21和P16、细胞周期素D1、周期素依赖性激酶(CDK)2、增殖细胞核抗原(PCNA)、转录因子(E2F)等，这些基因在调控细胞衰老的过程中发挥着重要作用〔19〕。本实验结果示，随着传代次数的增加，BMSCs表达衰老相关蛋白P53和P21增加，蛋白表达量明显高于低传代次数BMSCs。综上所述，体外培养传代次数的增加，BMSCs增殖能力明显下降，衰老细胞数量增加。为了避免复制性衰老对BMSCs功能研究的影响，建议使用P1-5代细胞。此外，深入研究BMSCs衰老的调控机制和作用靶点，可为延缓干细胞衰老及防治各种老龄化疾病提供重要的理论基础。