EsWnt-4基因的表达分析

刘志强，冯建彬，邱高峰

（上海海洋大学，农业部淡水产种质资源重点实验室，水产科学国家级实验教学示范中心，上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306）

调控果蝇（Drosophila melanogaster）幼体体节发育的 Winless基因［1］和小鼠（Mus musculus）乳腺瘤整合过程中发挥调控作用的int-1基因［2］属于同源基因，两类基因统称为 Wnt基因［3］。Wnt基因是一个大的基因家族［4］，Wnt-4基因是 Wnt家族重要的成员［5］，目前已在哺乳类［6-7］，鸟类［8］、鱼类［9］、两栖类［5］、爬行类［10］、软体动物［11-12］等物种中均有发现。并且实验证实其编码的WNT-4蛋白在许多生物事件中都发挥着重要的作用，如在雌性哺乳动物中WNT-4能够抑制性腺分泌雄性激素，从而导致雌性个体内雄性生殖细胞的分化，当雌性个体内Wnt-4基因缺失或突变后会导致缪勒氏管缺失和雄性化［6］。在雄性个体胚胎发育时，Wnt-4的过表达会使个体雄性激素分泌降低而导致睾丸发育受到影响，个体雌性化发育［7］；在鸟类和鱼类中，Wnt-4在发育的脑组织中高表达，并且能够抑制细胞的迁移［13-14］；在果蝇中，Wnt-4被证实能够调节视网膜成像的特异性［15］；而在一些软体动物中，Wnt-4在不同组织中均有表达的特征［11-12］，说明其可能参与软体动物的多种生命活动。

Wnt-4作为重要的调控因子，在许多生物中已有深入的研究，但是迄今为止在虾蟹等甲壳类生物中尚未见Wnt-4基因的报道。本实验从中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）卵巢组织的转录组数据库中筛选获得了中华绒螯蟹EsWnt-4基因的cDNA序列，然后对该基因在中华绒螯蟹不同组织的表达情况进行了RT-PCR检测，最后对该基因在不同发育时期的胚胎、幼体及仔蟹中的表达量进行了分析，以期为中华绒螯蟹EsWnt-4基因的功能研究及其它虾蟹类生物中Wnt基因的研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

EsWnt-4基因组织分布检测所用中华绒螯蟹于2016年10月购自上海市浦东新区南汇果园市场，其中雌蟹个体体长为4.5 cm，体宽为4.8 cm，体质量为96 g；雄蟹个体体长为5.1 cm，体宽为5.2 cm，体质量为104 g。待其冰上冷冻麻醉后将其解剖，取其精巢、卵巢、肌肉、心脏、鳃、肝胰腺、胸腹神经团、脑、眼柄等组织，迅速置入液氮中冷冻，然后-80℃保存备用。

抱卵期的中华绒螯蟹由上海海洋大学吴旭干老师于2015年1月提供，并在解剖镜下追踪其受精卵的发育时期，分别采集受精卵、1细胞期、2细胞期、4细胞期、8细胞期、16细胞期、囊胚期、原肠胚期、原溞状体期等不同胚胎发育时期的样品置于液氮中，并转移至-80℃保存备用。

根据之前描述的中华绒螯蟹幼体发育时期的分期方式，在2016年4—6月份自启东蟹苗养殖场采集中华绒螯蟹不同发育时期的幼体，包括第一溞状幼体、第二溞状幼体、第三溞状幼体、第四溞状幼体、第五溞状幼体、大眼幼体，将其置于液氮中，并转移至-80℃保存备用。将部分大眼幼体带至实验室进行养殖，待其发育到不同仔蟹时期时进行样品采集，用于RNA提取。

1.2 样品RNA的提取

根据Trizol试剂操作说明书提取所需样品的总RNA，具体操作为：取250μL Trizol试剂迅速加入-80℃保存的样品中，冰上充分匀浆后再加入750μL的 Trizol，剧烈震荡15 s，冰上放置5 min；加入200μL氯仿，颠倒混匀，冰上放置3 min；12 000 r·min-1、4℃离心 15 min；取上清至新的离心管中，加入500μL异丙醇，混匀，静置10 min；12 000 r·min-1、4℃离心 10 min；弃上清，加入1 mL75%乙醇，并用移液器吹打沉淀，然后75 000 r·min-1、4℃离心 5 min；小心的去除上清，待干燥后加入40μL无酶水；1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，酶标仪测定其浓度。

1.3 EsWnt-4 cDNA序列筛选及验证

对中华绒螯蟹卵巢转录组数据进行搜索，BLSAT及NJ聚类分析筛选出EsWnt-4基因的转录本序列（GenBank accession number：MH707438）。根据从转录组中获得的转录本序列的 3′及 5′端序列设计引物 EsWnt-4F1（5′-GAGGAGGAGGGGGAGGAGG-3′） 和 EsWnt-4R1（5′-GACCGCAACCTTCCGACG-3′），对转录组数据进行验证，并设计用于RT-PCR和荧光定量检测 时 的 上 下 游 引 物 （EsWnt-4F2：5′-AAGCAATGCCCAGCTTCAGG-3′和 EsWnt-4R2：5′-GGAGCCGCTGTTGATGTCGT-3′）。

1.4 EsWnt-4 mRNA的组织分布检测

分别取2μg各组织总RNA，用DNase去除样品总 RNA中可能混有的基因组 DNA。使用Prime Script II 1st Strand c DNA Synthesis Kit合成c DNA第一条链，并以中华绒螯蟹β-actin基因的上下游引物（β-actinF：5′-CGACGGTCAGGTC ATCACC-3′和 β-actinF ：5′-ACGTCGCACTTC ATGATGGA-3′）进行 PCR扩增，检测反转录效果。随后以EsWnt-4F2和EsWnt-4R2为上下游引物进行扩增，检测EsWnt-4在中华绒螯蟹不同组织的表达情况。

1.5 EsWnt-4在胚胎及幼体时期的表达检测

分别取中华绒螯蟹成熟的卵细胞、不同发育时期的胚胎及不同幼体时期样品的总RNA 2μg，按照1.4操作步骤反转录获得各样品的cDNA。以EsWnt-4F2和EsWnt-4R2为上下游引物，检测EsWnt-4在中华绒螯蟹受精卵、胚胎期、幼体期和仔蟹时期的表达情况。β-actin基因的表达量作为内参，采用2-△△Ct法对基因的相对表达量进行分析，使用SPSS17.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 中华绒螯蟹Wnt cDNA序列特征

从中华绒螯蟹卵巢转录组数据库中获得一个被注释为Wnt-4的RNA序列，长为1 027 bp，分析后发现其5′UTR为39 bp，3′UTR为155 bp，ORF为831 bp，其中在5′UTR处有一个核心碱基为“GGA”的微卫星片段（图1）。另外，ORF编码一个含277个氨基酸残基的多肽，其等电点为8.97，蛋白分子量为29.37Kd。另外，BLAST检测后发现该多肽含有一个WNT蛋白家族的保守区（图1）。

2.2 序列比对及系统进化树分析

利用 NCBI上 BLAST在线软件对 EsWnt-4 ORF编码的氨基酸序列进行分析，发现该多肽与节肢动物里绒虫 （Euperipotaidei kanangrensis）的WNT-4在保守区的同源性高达98%，与其它脊椎动物如人、牛等物种的WNT-4也有97%的同源性。随后，选取不同物种、不同亚族的WNT氨基酸进行聚类分析，结果显示，中华绒螯蟹的WNT首先与绒虫的WNT-4聚为一支，随后再和其它脊椎动物的WNT-4聚为一支。而其它亚族各成员也以很高的置信度分别聚在一起（图2）。基于此，将该实验克隆得到的 WNT基因命名为EsWnt-4。

图1 中华绒螯蟹Wnt基因cDNA序列及其编码的多肽序列Fig 1 The cDNA sequence of EsWnt gene and the deduced amino acids sequence注：灰色阴影标注的为微卫星序列，黑线标注的为WNT蛋白家族的保守区Note：The SSR sequence was marked with gray shade，the conservative region of WNT protein was underlined

图2 不同物种WNT氨基酸的系统进化树Fig.2 Molecular phylogenetic analysis of different WNT amino acids sequences

2.3 EsWnt-4在中华绒螯蟹各组织中的表达情况

RT-PCR检测结果显示，EsWnt-4在肌肉、肝胰腺、眼柄、鳃中不表达，在精巢、卵巢、胸腹神经团、心脏、脑中均有表达，但是表达量不同，其中在心脏、脑中的表达量最高，其次是精巢、卵巢，而在胸腹神经团中的表达量最低（图3）。

图3 EsWnt-4在成体中华绒螯蟹不同组织中的表达情况Fig.3 Expression of EsWnt-4 in different tissues of adult Eriocheir sinensis注：M：100bp DNA maker；Te：精巢；Ov：卵巢；Tg：胸腹神经团；He：心脏；Mu：肌肉；Hp：肝胰腺；Ey：眼柄；Br：脑；Gi：鳃Note：M：100bp DNA maker；Te：testis；Ov：ovary；Tg：thoracic ganglion；He： heart；Mu： muscle；Hp： hepatopancreas；Ey：eyestalk；Br：brain；Gi：gill

2.4 EsWnt-4在中华绒螯蟹胚胎发育过程中的表达量检测

荧光定量PCR结果显示，在成熟的卵母细胞及所检测的各时期胚胎内，EsWnt-4都有表达。其中，成熟的卵母细胞中EsWnt-4含量较低，受精后其含量升高。在开始卵裂以后EsWnt-4含量下降，直到8细胞时期EsWnt-4含量均低于其在受精卵中的含量。在16细胞期EsWnt-4表达量骤增至最大，随后其表达量又急剧下降，并在以后的胚胎发育期内均保持较低的表达量。

图4 EsWnt-4在中华绒螯蟹成熟卵细胞及胚胎时期的表达情况Fig.4 Relative expression of EsWnt-4 in mature eggs and embryos in different developmental stages of Eriocheir sinensis注：a：成熟卵细胞；b：受精卵；c：2细胞；d：4细胞；e：8细胞；f：16细胞；g：囊胚；h：原肠胚；i：原溞状体。*表示显著性差异（P＜0.05）Note：a：mature eggs；b：fertilized eggs；c：2-cell stage；d：4-cell stage；e：8-cell stage；f：16-cell stage；g：blastocyst；h：gastrula；i：protozoea.*indicate significant differences statistically（P＜0.05）

2.5 EsWnt-4在中华绒螯蟹胚胎幼体及仔蟹中的表达量检测

为了初步探索EsWnt-4基因在溞状幼体、大眼幼体及仔蟹等发育过程中的作用，笔者对第一至第五溞状幼体阶段、大眼幼体阶段及一期和二期仔蟹时期样品的RNA进行抽提，利用荧光定量PCR对EsWnt-4基因在这些时期内的表达量进行了测定。结果显示，在溞状幼体、大眼幼体及仔蟹中EsWnt-4基因均有表达，但是在第一溞状幼体、第三溞状幼体、第四溞状幼体、大眼幼体及仔蟹中EsWnt-4基因的表达量非常低，而在第二溞状幼体及第五溞状幼体时期EsWnt-4基因的表达量显著高于其它时期，且第五溞状幼体时期EsWnt-4基因表达量最高。

图5 EsWnt-4在中华绒螯蟹不同幼体及仔蟹时期的表达情况Fig.5 Relative expression of EsWnt-4 in larvae and juvenile Eriocheir sinensis注：j：第一溞状幼体；k：第二溞状幼体；l：第三溞状幼体；m：第四溞状幼体；n：第五溞状幼体；o：大眼幼体；p：第一仔蟹；q：第二仔蟹。*与**之间有显著性差异（P＜0.05）Note：j：zoea-1larvae；k：zoea-2 larvae；l：zoea-3 larvae；m：zoea-4 larvae；n：zoea-5 larvae；o：megalopa；p：juvenile-1 crab；q：juvenile-2 crab.*and**indicate significant differences statistically（P＜0.05）

3 讨论

Wnt-4在多种生命活动中具有重要的调控作用，如哺乳动物性别分化［6-7］，果蝇体节的形成和视网膜成像［1，15］，鸟类和鱼类生物神经组织的发育［4，14］等。此 外，在 栉 孔 扇 贝 （Chlamys farreri）［11］、厚壳贻贝（Mytilus coruscus）［12］等生物中，Wnt-4在不同的组织中都有表达，说明在这些物种中Wnt-4的功能并不单一。与此相同的是，中华绒螯蟹EsWnt-4基因在神经组织、心脏、性腺组织中均有表达，说明Wnt-4在中华绒螯蟹中也具有多种功能。

通常认为，在受精的过程中，精子仅将自身的遗传物质及组蛋白携带至受精卵中。但近期研究发现，精子在受精时还会将一些调控因子或调控因子的mRNA携带至受精卵中［16-19］。如在小鼠中，Wnt-4的mRNA便可由精子携带至受精卵中，并且该转录本还可以在早期的胚胎发育时翻译成蛋白，发挥功能［19］。在本实验中发现，中华绒螯蟹成熟的卵细胞中EsWnt-4基因的表达量很低，受精后其表达量明显上升，而在其后的2、4、8细胞期EsWnt-4的表达量又远低于受精卵时期，因此笔者推测，中华绒螯蟹的精子也可以将EsWnt-4基因的转录本携带至受精卵中。此外，胚胎发育的早期，由精子和卵细胞继承的基因处于沉寂状态，需要等到一定的发育阶段后才可以重新被激活并开始转录，完成受精卵的生命活动由母型调控向合子型调控的过渡［20］。不同种类物种胚胎基因被激活的时期各不相同。在果蝇、小鼠中来自亲本的遗传物质被重新激活是在2细胞期［21-23］；牛（Bos taurus）胚胎基因组的转录发生在 8细胞期［24］；绵羊（Ovis aries）胚胎中合子基因组启动转录时间大约发生在16细胞期［25］。但是，最近有实验证实，在一些生物中，受精卵的生命活动由母性调控向合子型调控过渡在精子与卵子染色体融合形成受精卵后就已经开始。因此，中华绒螯蟹受精卵中EsWnt-4 mRNA含量上升也有可能是受精卵自身基因被激活后转录所致。

在果蝇发育的早期，WNT4能够调控体节的发育［1］，中华绒螯蟹EsWnt-4基因在第二溞状幼体时期表达量迅速上升，而第二溞状幼体发育为第三溞状幼体时其腹节将会增加（由6节变为7节）［26］，说明EsWnt-4可能与中华绒螯蟹幼体发育时体节的形成有关。溞状幼体变为大眼幼体后，中华绒螯蟹个体会发生非常明显的形态学变化，包括头胸甲的形成、螯足的出现［26］等。EsWnt-4在第五溞状幼体时表达量达到最大，说明该基因在中华绒螯蟹由溞状幼体变为大眼幼体的过程中具有非常重要的作用。