丙酸杆菌代谢物与山梨酸钾抑菌作用比较研究

郑丽雪，黎英，王家皓，董苗苗，陈倩倩，齐斌，*

（1.常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500；2.苏州市食品生物技术重点实验室，江苏 常熟 215500）

长久以来，抑菌防腐一直是食品工业的研究重点，而山梨酸钾、苯甲酸钠等化学合成防腐剂因抑菌效果好且价格低廉而被广泛应用[1-4]。伴随着经济发展、时代进步，人们对生活质量的要求也逐步提高，更加关注衣食住行的品质，这对食品营养和健康提出了新的要求。传统食品防腐剂如苯甲酸钠等，多来源于化学合成，尽管价格低廉，但大剂量应用仍存在安全风险[5]。因此，高效、低毒防腐剂的开发依旧是食品科学研究的热点问题，而天然防腐剂具备这一特性，也能满足人们对高品质食品的需求。

微生物、植物产生的天然防腐剂广泛应用于食品、化妆品行业[6-12]。丙酸杆菌代谢物近年作为新型食品防腐剂也越来越得到国内学者的重视和青睐。丙酸杆菌代谢物是由乳品丙酸杆菌合成的细菌素，细菌素主要是多肽或蛋白质，其可通过多种机制抑制腐败菌[13-15]，已有研究表明，丙酸杆菌的代谢物质对食品的防腐也有一定的作用。贾彩凤[15]发现丙酸杆菌代谢物对恶臭假单胞菌具有抑制作用，并发现：5%的接种量，30 ℃培养72 h，丙酸杆菌代谢物抑菌活性较高。陈玉梅[16]比较了乳酸钠（sodium lactate broth，SLB）SLB、葡萄糖和脱脂乳3 种培养基对其丙酸杆菌代谢物抑菌作用的影响，发现：1%接种量的丙酸杆菌在葡萄糖培养基中培养到第8天时的抑菌活性最高。王海晶[17]研究了丙酸杆菌代谢物的抑菌作用，并对高产菌株发酵工艺进行了优化，发现：丙酸杆菌代谢物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为19.8 mm；葡萄糖、Tween 80、pH 值是影响抑菌活性的关键发酵参数。鉴与此，本文以费氏丙酸杆菌素为研究对象，以大肠杆菌和沙门氏菌为其指示菌，通过改变发酵培养基、接种量和初始培养pH 值3 方面，研究其代谢产物丙酸杆菌素对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用，并与山梨酸钾的抑菌作用进行对比，旨在为以后天然防腐剂的深入研究提供理论参考[18]。

1 材料与方法

1.1 材料

费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420，P.freudenreichii CS1420）、大肠杆菌、沙门氏菌：均为常熟理工学院生物与食品工程学院发酵工程中心保存。

山梨酸钾（纯度＞99.0%）、氯化钠（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；乳酸钠（纯度98%）、葡萄糖（分析纯）、十二水合磷酸氢二钠（分析纯）、磷酸二氢钾（纯度99.8%）：阿拉丁上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰酶水解酪素、酵母提取物、LB 液体培养基、7.5%氯化钠肉汤培养基：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-100A 型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DHP-9162303A-5S 型电热恒温培养箱；FA604A 型精密电子天平：上海精天电子仪器有限公司；UV-2450 型紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；PE20 型实验室pH 计：梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司；Milli-Q Advantage 超纯水仪：美国Millipore 公司；SW-CJ-1B 超净工作台：苏净集团安泰公司；CR22GⅡ型高速冷冻离心机：日本日立公司；Bio-Rad x Mark 酶标仪：美国 Bio-Rad 公司；HP100 抽气型厌氧罐：常州诺基仪器有限公司；BLBIO-5SJ-10SJ-A 发酵罐：连云港百仑生物；MHY-27766 二氧化碳发生器：北京美华仪科技有限公司。

1.3 培养基

1.3.1 丙酸杆菌培养基

1）乳酸钠培养基

胰酶水解酪素10 g，酵母提取物5 g，乳酸钠10 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2）葡萄糖培养基

用2%的葡萄糖代替乳酸钠培养基中的乳酸钠，其他成分不变，pH 7.0～7.2。

3）脱脂乳粉培养基

脱脂奶粉20g，酵母粉1g，蒸馏水1000mL，pH5.3。

1.3.2 大肠杆菌培养基[5]

酵母膏5 g，蛋白胨10 g，琼脂1 %～2 %，氯化钠10 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。

1.3.3 沙门氏菌培养基

蛋白胨10 g，氯化钠5 g，磷酸氢二钠（含12个结晶冰）9 g，磷酸二氢钾 1.5 g，蒸馏水 1 000 mL，静置10 min，煮沸溶解，调整 pH（7.0±0.2）。

1.3.4 0.1%的山梨酸钾溶液

称取0.1 g 的山梨酸钾溶解于灭好菌的100 mL 的乳酸钠培养基混合均匀。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化

将斜面保存的费氏丙酸杆菌菌株划线接种于乳酸钠固体培养基上，于30 ℃厌氧罐中厌氧培养2.5 d。

将斜面保存好的大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌分别接种于LB 液体培养基、7.5%氯化钠肉汤培养基中，37 ℃培养 12 h。

1.4.2 抑菌活性测定

采用酶标法测定代谢物的抑菌活性[13]。将离心后所得上清液用SLB 培养基溶液进行2N梯度稀释，然后将不同稀释倍数的稀释液分别加入96 孔酶标板中，每个孔的体积为200 μL，其中100 μL 为不同稀释倍数的抑菌物质，100 μL 为指示菌培养液，并以 100 μL 的SLB 培养基和100 μL 的指示菌培养液作为对照，制得酶标板后将其置于37 ℃培养箱中培养12 h。用酶标仪测定每孔在600 nm 处吸光值。当测定的OD 值为对照组的一半，则代谢产物的稀释度为一个抑菌活力单位，单位为 AU/mL[19]。

1.4.3 时间对丙酸杆菌抑菌活性影响

将培养好的种子液接入装有乳酸钠培养基的三角瓶中，30 ℃，厌氧培养2.5 d。将扩大培养好的种子液按10%接种量接种至5 L 发酵罐中，30 ℃，100 r/min，发酵期间通入CO2使罐压保持0.05 MPa，控制pH 值为6.0，连续培养8 d，期间每天取样测量菌体干重及发酵液抑菌活性[20]。以此考察丙酸杆菌抑菌活性随时间变化，得到丙酸杆菌抑菌活性最佳培养时间。

1.4.4 3 种不同培养基培养得到的丙酸杆菌代谢物与山梨酸钾抑菌作用比较

将活化好的P.freudenreichii CS1420 分别接种于葡萄糖培养基、SLB 培养基和脱脂乳培养基中，发酵培养时间根据1.4.3 试验结果确定，得到丙酸杆菌代谢物后在5 000 r/min 条件下离心15 min，取其上清液采用“2 倍系列稀释法”[21]稀释处理，直至稀释度为2-8截止。后制其酶标板并且每个稀释度做3个平行。对其抑菌活性进行测定，以考察不同培养基培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌情况，并与山梨酸钾抑菌作用比较分析。

1.4.5 不同接种量培养的得到的丙酸杆菌代谢物与山梨酸钾抑菌作用比较

将丙酸杆菌种子液以4%、5%、6%、7%、8 %的接种量分别接入1.4.4 试验所得的丙酸杆菌最佳发酵培养基的锥形瓶中，于30 ℃培养箱中培养，培养时间根据1.4.3 试验结果确定。抑菌活性测定方法同上，以考察不同接种量培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性，并与山梨酸钾抑菌作用比较分析。

1.4.6 不同初始pH 值培养得到的丙酸杆菌代谢物与山梨酸钾抑菌作用比较

将丙酸杆菌培养基初始pH 值分别设定为5、5.5、6、6.5、7，5个梯度分别进行发酵培养。培养时间、培养基的类型和接种量的多少根据1.4.3、1.4.4、1.4.5 的结果依次确定，抑菌活力测定方法同上。以考察在不同初始pH 值培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性，并与山梨酸钾抑菌作用比较分析。

2 结果与讨论

2.1 丙酸杆菌抑菌活性随时间变化曲线

发酵时间对丙酸杆菌抑菌活性的影响如图1所示。

图1 丙酸杆菌抑菌活性随时间变化曲线Fig.1 Curve of antibacterial activity of Propionibacterium with time

由图1可知，P.freudenreichii CS01 在生长 24 h 后进入对数生长期，抑菌活力值呈现几何级数增大，在72 h 后抑菌活性值变得缓慢，直到96 h 进入稳定期，192 h 后抑菌活力值最大。试验选择的培养时间应选择其菌体稳定期，生长量大，酶系活跃，抑菌活力最佳且代谢旺盛的菌体[22]，因此选取培养时间为192 h 的发酵液进行抑菌作用的比较试验。

2.2 不同培养基培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌作用与山梨酸钾的比较

通过酶标法所测定不同培养基培养得到的丙酸杆菌代谢物，对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌活性与山梨酸钾的抑菌情况进行对比分析。结果如图2、图3所示。

图2 不同培养基培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌的抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different culture media on E.coli

图3 不同培养基培养得到的丙酸杆菌代谢物对沙门氏菌的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different media cultures against Salmonella

由图2、图3可以看出，试验所选择的3 种丙酸杆菌培养基（葡萄糖、SLB、脱脂乳）均对大肠杆菌和沙门氏菌有一定的抑制作用，当在SLB 培养基上培养后所得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性均能达到最佳，分别为25.3 AU/mL 和18.3 AU/mL，其抑菌效果优于相同条件下的山梨酸钾。但是在脱脂乳培养基培养后所得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性的效果却不如传统防腐剂山梨酸钾。

在脱脂乳培养基培养后所得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果不及在SLB、葡萄糖培养基上培养后所得到的丙酸杆菌代谢物和传统防腐剂山梨酸钾对指示菌的抑制效果，抑菌活性分别为13.6 AU/mL 和10.9 AU/mL。其可能原因是由于脱脂乳培养基本身的初始pH 值就比较低，再加上丙酸杆菌在生长过程中也会产生丙酸、乙酸等有机酸[23]，致使丙酸杆菌在脱脂乳培养基上生长速度较为缓慢，代谢产物生产量少，故相较其他两种培养基所产生的代谢产物对指示菌的抑制效果也不太理想。

因此，从数据分析比较来看，实际生产中可选择SLB 培养基或者葡萄糖培养基对丙酸杆菌进行发酵培养，所得其代谢产物丙酸杆菌素对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果要优于0.1%的山梨酸钾。

2.3 不同接种量培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌作用与山梨酸钾的比较

通过酶标法所测定不同接种量培养得到的丙酸杆菌代谢物，对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌活性与山梨酸钾的抑菌情况进行对比分析。结果如图4、图5所示。

图4 不同接种量培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different inoculum cultures against E.coli

图5 不同接种量培养得到的丙酸杆菌代谢物对沙门氏菌的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different inoculum cultures against Salmonella

由图4、5 可以看出，接种量的多少对丙酸杆菌发酵所产生的代谢产物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果还是有一定的影响。比较之下接种量为5%培养发酵后所得的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌活性均能达到最佳，分别为28.8 AU/mL 和18.1 AU/mL，其抑菌效果优于相同条件下的山梨酸钾。但是通过增大其接种量，产生的代谢产物对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌活性呈下降趋势，当接种量为8%时其抑菌活性分别仅为16.2 AU/mL 和10.5 AU/mL，比较于山梨酸钾的21.1 AU/mL 和14.0 AU/mL，其抑菌效果要差于山梨酸钾对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果。其原因可能是因为虽然增大其接种量可以缩短延滞期，加快菌体的生成，使得产物形成期得以提前；但是也并非接种量越大越好，接种量的过大会导致其菌体生长速度过于快速，也较早的消耗培养基中的营养成分，使得培养后期菌体得不到充足的营养而造成培养基粘度增大等一系列不良变化[2]。

因此生产中应选用接种量为5%或6%时其抑菌效果要优于0.1%的山梨酸钾，更能达到对大肠杆菌和沙门氏菌抑制效果。

2.4 不同初始培养pH值培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌作用与山梨酸钾的比较

不同初始培养pH 值培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌作用与山梨酸钾的比较，结果见图6、图7。

图6 不同初始pH值培养得到的丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌的抑菌活性Fig.6 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites cultured at different initial pH values against E.coli

图7 不同初始pH值培养得到的丙酸杆菌代谢物对沙门氏菌的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different initial pH values on Salmonella

由图6、图7可以看出，初始pH 值的不同对沙门氏菌的抑菌效果差距较为明显，而对大肠杆菌的抑制效果差距相差不大。对于大肠杆菌来说，在pH 值为5.5、6、6.5 时其抑菌活性分别为 27.5、26.1 AU/mL 和26.9 AU/mL。由此可见pH 值为5.5～6.5 之间，比于0.1%的山梨酸钾抑菌活性值为21.1 AU/mL，丙酸杆菌代谢物对大肠杆菌抑菌效果优于山梨酸钾。生产中选用初始pH 值为6.5 时能达到较好的抑菌效果。

当选择初始pH 值为5 时，培养后的丙酸杆菌代谢物无法利用酶标法计算其对沙门氏菌的抑菌活性，在 pH 值为 5.5、6、6.5、7 时其抑菌活性分别为 12.1、14.5、7.9 AU/mL 和 14.1 AU/mL。由此可见 pH 值为 6时，丙酸杆菌代谢物对沙门氏菌有很好的抑菌效果。相比于山梨酸钾抑菌活性值为14.1 AU/mL，0.1%的山梨酸钾抑菌效果与丙酸杆菌素对沙门氏菌的抑制效果相差不大。

3 结论

改变丙酸杆菌的发酵培养基、初始培养pH 值、接种量3个方面进行研究，再与0.1%的山梨酸钾抑菌作用进行一定的比较分析后：

1）从费氏丙酸杆菌生长抑菌活性随时间变化试验可知，在第192 h 抑菌值最佳。因此选取培养时间为第192 h 的发酵液进行抑菌作用的比较试验。

2）从选择的葡萄糖、SLB、脱脂乳3 种丙酸杆菌培养基来看，在SLB 培养基发酵得到的丙酸杆菌素均对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌活力达到最佳值分别为25.3 AU/mL 和18.3 AU/mL，相比较的山梨酸钾的抑菌活性为21.1、14.1 AU/mL，可见其抑菌活性较优于传统的山梨酸钾，但是丙酸杆菌在脱脂乳培养基上后所得到丙酸杆菌素的抑制效果却不及传统的山梨酸钾。

3）对于接种量而言，选择SLB 培养基进行发酵培养后，结果表明丙酸杆菌代谢物接种量为5%或6%时其大肠杆菌抑菌活力值均能达到28.1 AU/mL，其抑菌效果要优于传统的山梨酸钾。对于沙门氏菌而言，接种量为5%时沙门氏菌抑菌活力值达到18.0 AU/mL，其抑菌效果会优于传统的山梨酸钾；对于接种量为8%时对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌效果要不及山梨酸钾。

4）对于不同初始pH 值而言，同样选择SLB 作为其发酵培养基，接种量为5%后，结果表明丙酸杆菌代谢物初始培养pH 值为6.5 时其抑菌活性对大肠杆菌所产生抑菌效果最佳值为26.9 AU/mL，初始培养pH值为6 时其抑菌活性对沙门氏菌所产生抑菌效果最佳值为14.5 AU/mL。与0.1%的山梨酸钾的抑菌效果相比较而言，其对沙门氏菌的抑菌效果与丙酸杆菌代谢物抑菌效果相当，生产中选用初始pH 值为6 时也能达到较好的抑制效果。