IL1RAP在健康奶牛与患子宫内膜炎奶牛子宫内膜组织间表达差异的研究

陈秀竹，常 迪*，黄启震，王 瑞，王天坤，盛熙晖，齐晓龙，王相国，郭 勇，刑 凯，倪和民，谷传慧

(1.北京农学院 动物科学技术学院，北京 102206；2.昌平区动物疫病预防控制中心，北京 102200； 3.北京市动物疫病预防控制中心，北京100029)

子宫内膜炎是奶牛常见的产科疾病，主要病因是子宫内侵入病原微生物导致子宫内膜发生炎症。子宫内膜炎主要损伤子宫内膜的上皮细胞，使子宫内积脓，并影响早期胚胎着床等生殖过程，导致奶牛的繁殖性能下降[1]。临床研究显示，奶牛子宫内膜炎主要分为临床型子宫内膜炎和亚临床型子宫内膜炎两种类型。由于各种炎症在子宫内侵袭的程度上存在差异，所以修复子宫内膜所需要的时间存在差异，进而对母牛繁殖性状的影响也存在差异。国内外都有大量该病的研究报道，不同地区子宫内膜炎的发病情况各有不同[2]。另外，由于患病牛自身的免疫能力存在差异，也导致奶牛的发病情况有所不同[3]。当前，该病的诊断方法有直肠检查这类常规方法，还包括细胞学检查以及PCR技术在内的新技术[4]，应用分子标记技术对母牛遗传免疫进行了相关的分析和研究，对致病菌进行快速的归类，以寻找到更好的预防和治疗子宫内膜炎最有效的办法。目前一项研究显示，在牛对由子宫内膜炎等细菌感染导致的疾病的抵抗能力方面，细胞白介素1受体辅助蛋白(interleukin 1 receptor accessory protein，IL1RAP)基因可对该种免疫力加以提高，并且IL1RAP是牛子宫内膜炎的抗性候选基因[4]。

IL1RAP最先被鉴定为小鼠细胞中的IL-1型受体复合物的亚基，其有助于受体对IL-1的亲和力，并且是IL-1信号转导所必需的基因[5-10]。IL1RAP是IL-1信号传导中所需的受体配偶体，表达翻译形成膜IL1RAP和可溶性IL1RAP 两种形式，并且在机体中广泛表达[11-12]。有研究表明，IL1RAP可以当做新型的白血病干细胞表面标志蛋白[13]。也有研究表明，IL1RAP在人类子宫内膜异位症患者中的外周血以及子宫组织中表达下降，而子宫内膜异位症导致子宫发炎[14]。探明IL1RAP在健康奶牛与患子宫内膜炎奶牛间的表达差异，初步验证IL1RAP与奶牛子宫内膜炎的关系，为将IL1RAP作为奶牛子宫内膜炎的抗性基因提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用荷斯坦奶牛，挑选年龄相仿且经产2次的健康奶牛3头及经产2次的患子宫内膜炎奶牛3头。

1.2 样品采集与检测

观察奶牛外阴部位是否存在污浊分泌物进行初步选定，操作人员通过奶牛的阴道分泌物涂片，鉴别奶牛是否患有子宫内膜炎，通过鉴别子宫内病灶声像显示图并且通过仪器测量子宫颈的直径厚度以及依据子宫内液体的反射强度来确诊患病奶牛。

将经产健康奶牛3头，经产患子宫内膜炎奶牛3头，屠宰后分别取其子宫组织，然后将子宫组织迅速剪成1 cm见方的小组织块，随后快速置入液氮中处理，待冷冻完全后，将其置于处理过的离心管中并作标记，在-80 ℃冰箱中保存备用。

将子宫组织块进行荧光PCR技术检测,以GAPDH为参照，将cDNA样品稀释10倍，作为模板上机检测，所用等引物序列如表1。

western blot检测，组织块提取蛋白后，利用兔抗IL1RAP多克隆抗体以及Anti-rabbit IgG二抗进行试验。

表1 基因的引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

利用Excel软件汇总数据，荧光PCR数据分析方法为2-ΔΔCt相对定量分析方法，采用SPSS软件对检测数据进行t检验分析。

2 结果与分析

2.1 奶牛的IL1RAP mRNA相对表达量

荧光定量PCR内参基因GAPDH以及目的基因IL1RAP的扩增曲线如图1，荧光定量PCR内参基因GAPDH及目的基因IL1RAP的溶解曲线如图2。通过扩增曲线可以看出反应效果良好，并且通过溶解曲线分析IL1RAP以及GAPDH基因分别在81.97 ℃及86.67 ℃处，出现单一产物峰。

以内参基因GAPDH为内标，SYBRGreen染色法对IL1RAP mRNA在奶牛子宫组织中的相对表达量进行PCR检测，其中健康奶牛子宫组织中IL1RAP mRNA的相对表达量显著高于患子宫内膜炎奶牛子宫组织中IL1RAP的相对表达量(P<0.05),如图3所示。

图1 内参基因GAPDH的扩增曲线(左)目的基因IL1RAP的扩增曲(右)Fig.1 Amplification curve of the internal reference gene GAPDH (left) Amplification of the target gene IL1RAP (right)

图2 内参基因GAPHD的溶解曲线(左)目的基因IL1RAP的溶解曲线(右)Fig.2 Dissolution curve of the internal reference gene GAPDH gene (left) Dissolution curve of target gene IL1RAP (right)

图3 健康奶牛与患病奶牛子宫组织中IL1RAP的mRNA相对表达量Fig.3 mRNA Relative expression of IL1RAP in uterus tissue of healthy and diseased cows

2.2 奶牛的IL1RAP 蛋白相对表达量

通过Western Blot电泳试验，以β-catin为内参基因，得出电泳图如图4所示。图5为IL1RAP 蛋白在奶牛子宫组织中的相对表达量，可以看出健康奶牛子宫组织中IL1RAP蛋白的相对表达量极显著高于患子宫内膜炎奶牛子宫组织中IL1RAP蛋白的相对表达量(P<0.01)，IL1RAP蛋白相对表达量与奶牛子宫内膜炎存在相关性。

健康奶牛1号(Z1)子宫组织与患子宫内膜炎奶牛1号(H1)子宫组织中IL1RAP蛋白的表达量图。健康奶牛2号(Z2)子宫组织与患子宫内膜炎奶牛2号(H2)子宫组织中IL1RAP蛋白的表达量图。健康奶牛3号(Z3)子宫组织与患子宫内膜炎奶牛3号(H3)子宫组织中IL1RAP蛋白的表达量图图4 奶牛子宫组织中IL1RAP蛋白表达检查结果 The expression level of IL1RAP protein in uterus tissue of healthy cow No. 1 (Z1) and uterus of endometritis cow No. 1 (H1). The expression level of IL1RAP protein in uterus tissue of healthy cow No. 2 (Z2) and uterus tissue of endometritis cow No. 2 (H2). Expression of IL1RAP protein in uterus tissue of healthy cow No. 3 (Z3) and endometritis cows No. 3 (H3)Fig.4 Results of IL1RAP protein expression in cow uterus tissue

图5 IL1RAP 蛋白在奶牛子宫组织中的相对表达量Fig.5 Relative expression of IL1RAP protein in dairy uterus

2.3 讨 论

IL1RAP首先被鉴定为小鼠细胞中的IL-1受体复合物的亚基，其有助于受体对IL-1的亲和力[5,6]，是IL-1信号转导所必需的物质[7-10]。试验表明，人类编码IL1RAP的基因位于染色体3q28上[12]，通过表达翻译，形成膜 IL1RAP 和可溶性 IL1RAP 两种形式。研究发现，IL1RAP在慢性粒细胞白血病干细胞上表达显著升高，在正常造血干细胞上不表达或低表达。IL-1信号传导需要一型IL-1受体(IL-1RI)和IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAP)作为受体配偶体。研究发现，IL1RAP已被证明可以改善胶原诱导的关节炎，主要由于其有效的抗炎特性、促血管生成和生长特性[15]。可溶性IL1RAP在人血清中检测到，似乎通过增加IL1与sIL1R2结合的亲和力来发挥IL1反调节作用[16]，而子宫内膜异位症患者外周血中sIL1R2浓度降低[17,18]，可以推出人子宫内膜异位症患者外周血中IL1RAP减少。白细胞介素-1β(IL-1β)在损伤感染时以及疾病过程中被合成释放，介导炎症反应，相当于一种促炎性的细胞因子，其具有大范围的表达谱，大量的细胞都可以进行表达，当机体处于正常状况下的时候，其通常不会表达，只有当机体发生炎症的时候，在炎症信号的刺激作用下，能够将其进行快速的组合和分泌，在慢性炎症和肿瘤的发展过程中起到了重要作用[19]。而IL1RAP存在于IL-1β负调控通道上，因此可以推断，该基因与牛子宫内膜炎抗性可能存在着某种相关关系[23]。IL1RAP表达和中性粒细胞在负相关方向上运动[24]。研究显示，患有子宫内膜炎的牛的中性粒细胞明显提高(P<0.05)[4]。在反刍动物血液中，中性粒细胞占比很大(45%左右)，是对细菌进行的第一道防线的抵御，在炎症产生以后，他们是首批进入炎症区的细胞，由此可以判断，在如子宫内膜炎等由细菌感染引起的疾病中，ILIRAP可以提高对其的抵抗能力，能够成为牛对子宫内膜炎的抗性候选基因。

本试验结果得出患子宫内膜炎奶牛子宫组织中IL1RAP mRNA以及蛋白相对表达量均显著低于健康奶牛子宫组织中IL1RAP mRNA以及蛋白相对表达量，发现可能与子宫内膜炎的病理生理学有重要关联。实际上，IL1RAP包含两种形式，可溶性IL1RAP是IL-1的主要特异性抑制剂，并因此在促炎细胞因子的下调中起重要作用，导致炎症效应[25-27]。IL1RAP较低的循环水平可能与子宫内膜炎病理生理学中的可溶性IL1RAP表达缺乏相关，导致IL1介导的炎症的反调节机制显著缺乏[25,27-29]。

3 结 论

患子宫内膜炎奶牛子宫组织中IL1RAP的mRNA以及蛋白相对表达量比健康牛子宫组织中的相对表达显著降低，为证明IL1RAP为奶牛子宫内膜炎的抗性基因提供支撑。