玉米穗发芽突变体vp-like8的遗传分析及突变基因鉴定

王 瑞 陈阳松 孙明昊 张秀艳 杜依聪 郑 军,*



玉米穗发芽突变体的遗传分析及突变基因鉴定

王 瑞1,**陈阳松1,**孙明昊1,2张秀艳3杜依聪1郑 军1,*

1中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081;2吉林农业大学农学院, 吉林长春 130118;3中国农业大学生物学院, 北京 100193

玉米突变体具有明显的穗发芽性状且能稳定遗传, 遗传分析表明该突变性状受隐性单基因控制。用与自交系郑58杂交构建F2遗传定位群体, 利用BSR-Seq方法, 将基因初定在玉米第3染色体160.4 Mb~165.6 Mb区间内。参考玉米基因组信息, 发现已报道的穗发芽基因位于此定位区间内。分别利用、的杂合突变体进行等位测验, 发现杂交后代中正常与穗发芽籽粒符合3∶1遗传分离比。经序列分析, 发现突变体中基因在第2内含子有343 bp碱基的缺失, 且第3内含子有222 bp重复序列的插入, 而已报道的突变体只在第2个内含子有343 bp碱基的缺失。通过实时定量PCR检测发现, 与正常籽粒相比,与突变籽粒中基因的转录水平均明显降低。以上证据表明,是一个新的基因等位突变体。

玉米; 穗发芽; 突变体;; 基因定位

穗发芽严重影响作物的产量与品质, 给农业生产造成巨大的损失。早在20世纪20年代, 就已经有玉米穗发芽相关的研究报道[1-5]。截至目前已发现十多个玉米穗发芽突变体, 通过对这些突变体基因的克隆, 发现这些突变体大多是植物激素脱落酸(ABA)合成途径或信号转导途径受阻, 从而导致穗发芽的表型。根据Robertson的评定标准[6], 将已鉴定的玉米穗发芽突变体分为两种类型。一类是胚乳和幼苗的颜色不发生改变的突变体, 包括/、、/、和[7-12]; 另一类是玉米籽粒颜色发生改变的突变体, 该突变体植株类胡萝卜素和叶绿素的生物合成受到影响, 包括、、/、、和/[13-18]。

是玉米中典型的ABA不敏感突变体,基因编码一类特异的转录因子, 在玉米种子发育成熟过程中的胚和胚乳中特异表达, 调控种子对植物激素ABA的响应过程[7]。研究表明位于VP1蛋白氨基端的保守结构域对ABA信号转导至关重要, 而VP1蛋白最大的保守区域B3则在ABA含量较低时起重要作用, B3结构域与下游基因的启动子结合, 并激活其表达[21]。此外, 通过对突变体中糊粉层和胚组织中的花青素合成受阻现象深入研究, 发现VP1蛋白可能通过与多个转录因子互作, 进而激活基因来控制花青素代谢[19], 表明VP1转录因子在种子成熟过程中参与了多个信号转导过程。

研究作物穗发芽的遗传调控, 克隆穗发芽相关基因, 将为深入解析作物穗发芽的分子遗传机制, 以及鉴定和筛选耐穗发芽的种质资源奠定基础。尽管目前已克隆多个玉米穗发芽基因, 但玉米籽粒穗发芽形成的分子遗传调控网络仍不够清晰。因此, 有必要进一步鉴定新的玉米穗发芽突变体, 克隆更多的穗发芽基因, 并深入研究其调控玉米穗发芽的遗传机制。本研究对一个新发现的玉米穗发芽突变体(命名为)进行遗传分析和基因定位, 经等位测验和突变基因的分子鉴定发现,是基因的一个新等位突变体。该研究为进一步探索玉米穗发芽的分子遗传机制丰富了实验材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米突变体是本实验室在玉米繁种过程中新发现的一个穗发芽突变体。授粉后30 d,杂合植株的果穗上呈现出明显的穗发芽分离的表型。利用杂合体与自交系郑58杂交, 然后再自交得到F2群体用于基因定位。基因突变体326B()订购自Maize Genetics Cooperation Stock Center (玉米遗传学合作库存中心, https:// maizecoop.cropsci.uiuc.edu/request)。

1.2 vp-like8突变体的表型鉴定和遗传分析

由于玉米果穗成熟收获时, 穗发芽的胚芽已脱水干枯致死, 因此突变体以杂合体形式保存。随机选取有穗发芽分离果穗上的正常籽粒种植, 自交后代中, 再选取有穗发芽表型果穗上的正常籽粒种植。以此方式连续多代自交, 观察突变体的遗传稳定性, 并进行遗传分析。在每一世代自交授粉后30 d, 对穗发芽的表型进行鉴定, 剥开果穗苞叶, 选取出现穗发芽表型的果穗, 脱粒并统计正常与穗发芽籽粒的分离比。

1.3 目的基因的初定位

BSR-Seq方法已被证明适用于玉米突变体基因的定位与克隆[22-23], 本研究利用该方法对突变体基因进行初定位。授粉后30 d, 随机挑选出现穗发芽表型分离的F2果穗, 分别挑选40粒正常和穗发芽籽粒, 去除种皮后分别混合成2份实验样品, 液氮速冻并迅速研磨至粉末, 使用植物总RNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司, Cat# DP432)提取样品总RNA。利用Illumina HiSeq2000型测序仪(北京贝瑞和康生物技术有限公司)进行转录组测序。参照BSR-Seq分析流程[22], 比对、分析测序结果, 提取样本间的SNP标记, 计算SNP标记与突变基因的连锁概率, 分析获得基因的初定位区间。

1.4 定位区间基因检索及等位测验

根据BSR-Seq 数据, 将基因定位于第3染色体160.4 Mb~165.6 Mb区间内, 利用MaizeGDB数据库网站(http://www.maizegdb.org/), 检索该定位区间内所有基因的注释信息, 发现该区间内存在已经报道的玉米穗发芽基因[7]。

为检测与是否等位, 随机挑选、杂合体后代中正常籽粒(基因型应为野生型或杂合型), 各种植2行, 每行25株。开花授粉时, 任选中一行单株自交, 并收集此行所有单株花粉进行混粉作为父本, 分别授予中一行的每一单株。同理,的另一行的每一单株自交, 同时分别收集此行每个单株的花粉, 混粉后作为父本与的另一行的每一单株杂交。授粉30 d后, 剥开苞叶, 检查是否有穗发芽突变表型的果穗[23]。

1.5 基因组DNA提取、PCR扩增和序列分析

用CTAB方法分别提取突变体和授粉后30 d分离果穗上正常与穗发芽籽粒的基因组DNA[24]。依据基因组序列, 利用Primer3引物设计软件(http://primer3.ut.ee/), 设计8对引物(VP1-G- F1/R1~VP1-G-F8/R8)(表1), 扩增产物瓦片式覆盖了基因组序列。分别以突变体与基因组DNA为模板, 扩增基因片段, 将PCR产物进行测序(北京六合华大基因科技有限公司), 分析测序结果, 分别判断基因的突变情况。PCR 扩增体系为2 × KOD buffer 25 µL, 引物(10 µmol L–1) 0.75 µL, 模板DNA 2 µL, dNTPs (2.5 µmol L–1) 5 µL, KOD FX酶(1.0 U µL–1) 1 µL, 用超纯水补至50 µL。PCR扩增条件为94℃预变性5 min; 94℃变性10 s, 59℃退火30 s, 68℃延伸1 min, 循环数为35; 68℃延伸7 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带[23]。

表1 本研究所用的引物

1.6 vp-like8和vp1再次等位测验

依据测序结果, 分别用特异引物(VP1-G-F4/ R4、VP15-G-F6/R6), 准确鉴定出与的杂合突变体。取杂合突变体花粉, 授予杂合突变体植株; 同理, 取杂合突变体花粉授予杂合突变体植株。授粉后30 d, 检测果穗上籽粒穗发芽情况, 统计分离比[23]。

1.7 RNA的提取及基因表达量分析

授粉后30 d, 取穗发芽和正常的籽粒, 去除种皮, 提取籽粒RNA (同上)。利用反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司, Cat# AU311-02)反转录为cDNA, 设计特异引物VP1-CDS-F1/R1, 以GAPDH作为内参引物(表1), 利用ABI 7300实时定量PCR仪进行基因的表达分析。PCR体系为dye I 0.4 µL, 10´qMix 10 µL, 引物(10 µmol L–1) 0.5 µL, 模板cDNA 1 µL, 补灭菌超纯水至20 µL。PCR扩增条件为95℃预变性2 min, 95℃变性10 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 设置40个循环, 在72℃延伸30 s阶段收集荧光, 并添加熔解曲线, 用公式2–ΔΔCt计算正常和穗发芽籽粒中基因表达量差异[23]。

2 结果与分析

2.1 突变体vp-like8的表型和遗传分析

正常情况下, 玉米授粉后30~40 d, 随着籽粒胚乳的硬化, 玉米籽粒逐渐成熟。但对于突变体杂合体的果穗, 授粉后30 d, 呈现出明显的穗发芽分离表型(图1-A)。籽粒完全成熟收获时, 穗发芽籽粒提前萌发的胚芽已干枯致死(图1-B, C), 经连续自交, 发现穗发芽性状能够稳定遗传。如表2所示, 随机挑选有穗发芽性状分离的果穗, 统计分离比, 经卡方检验发现其分离比符合3∶1, 表明突变体穗发芽性状由单隐性核基因调控。

图1 vp-like8突变体穗发芽表型

A: 授粉30 d 后突变体杂合果穗上的穗发芽籽粒和正常籽粒; B: 授粉后60 d后突变体杂合果穗上穗发芽籽粒和正常籽粒; C: 成熟的正常籽粒(WT)和穗发芽籽粒(); 标尺=1 cm。

A: viviparous and normal kernels on aheterozygous ear at 30 days after self-pollination; B: viviparous and normal kernels on aheterozygous ear at 60 days after self-pollination; C: mature normal (WT) and viviparous kernels (); Bar = 1 cm.

表2 vp-like8杂合突变体自交授粉后正常籽粒和穗发芽籽粒的分离情况

χ2(0.05)(1)=3.84.

2.2 Vp-like8基因定位

BSR-Seq基因定位发现, 在玉米10条染色体中, 只有第3染色体出现一个明显的峰。以> 0.5作为标准, 将基因定位在第3染色体160.4 Mb~ 165.6 Mb区间内(图2)。

2.3 vp-like8和vp1初步等位测验

分析发现在初定位的区间内存在已报道的基因, 为判断二者是否为同一个基因, 通过和杂合体的正反交进行了等位测验。在杂合突变体混粉杂交的果穗中, 发现有穗发芽分离的果穗(图3-A); 同时, 在杂合突变体混粉杂交的果穗中, 也发现有穗发芽分离的果穗(图3-B)。初步证明突变体很有可能是基因的一个等位突变体。

图2 利用BSR-Seq方法对vp-like8突变体基因的初定位

2.4 vp-like8突变位点鉴定

为准确验证和是等位基因并鉴定的突变位点, 参考基因组序列(基因组序列全长5085 bp, 有6个外显子, 开放阅读框共2717 bp), 共设计8 对PCR引物(表1), 分别扩增、突变体基因组DNA, 扩增产物起始于起始密码子上游−423 bp, 到终止密码子下游1088 bp结束, 瓦片式覆盖了基因组序列。测序发现,突变体中基因在第2内含子处缺失343 bp碱基, 且在第3内含子插入222 bp的重复序列; 而突变体只在第2内含子处缺失343 bp碱基 (图4)。由此证明, 这2个突变体的基因突变方式不同, 即是一个新的等位突变基因。

图3 利用杂合体对vp-like8和vp1进行等位测验

A: 以杂合突变体混粉杂交的果穗上出现穗发芽籽粒。B: 以杂合突变体混粉杂交的果穗上出现穗发芽籽粒。

A: viviparous kernels were emerged onheterozygous ear crossed by the mixed pollen ofheterozygous plants; B: viviparous kernels were emerged onheterozygous ear crossed by the mixed pollen ofheterozygous plants.

图4 Vp1基因结构示意图及突变体的突变位置

根据和在基因上的突变位置, 设计特异引物VP1-G-F6R6、VP1-G-F4R4, 分别鉴定出和杂合体, 利用杂合体植株再次进行等位测验。授粉后30 d, 检查穗发芽情况, 发现无论是正交(×), 还是反交(×), 杂交果穗都出现穗发芽表型的分离。统计分析, 发现正常与穗发芽籽粒符合3∶1分离比(表3)。进一步确认突变体就是基因的等位突变体。

2.5 Vp1基因在vp-like8突变体中的表达检测

选取和杂合体, 分别提取其自交果穗中正常和穗发芽籽粒的总RNA, 采用实时荧光定量PCR的方法, 检测基因的转录水平。如图5所示, 在突变体和中, 穗发芽籽粒基因的表达量都显著低于正常籽粒, 表明和中不同方式的突变都影响了基因正常转录。

表3 vp-like8与vp1突变体等位测验

χ2(0.05)(1)=3.84.

图5 实时定量PCR检测Vp1基因分别在vp-like8、vp1突变体的正常(normal)和穗发芽(vp)籽粒中的表达量

3 讨论

玉米穗发芽性状受种子内各内源激素水平的影响, 其中植物激素ABA可促进未成熟种子中胚的发育及成熟种子的休眠等过程[25]。近年来, 玉米穗发芽突变体的研究已相对深入, 发现ABA与玉米穗发芽表型密切相关, 无论ABA 信号转导途径异常还是ABA合成途径受阻, 都会发生穗发芽突变。目前所发现的玉米穗发芽突变体大多是ABA合成途径异常所致, 而ABA信号转导异常导致的相对较少。

已有研究报道,是单拷贝基因, 编码分子质量为73,335道尔顿的蛋白质, 特异地在种子发育过程中的胚和胚乳里表达[7]。玉米VP1激活胚成熟和胚休眠相关基因的表达, 参与玉米胚成熟发育进程的调控[19], 且抑制与种子萌发相关基因的表达[26]。玉米VP1是拟南芥ABI3的同源蛋白, 是种子发育进程中重要的转录调节因子, 拟南芥ABI3调控胚发育过程。研究表明, ABI3调控胚芽休眠、质体发育和开花等过程[27-31]。本研究中在第2内含子处缺失343 bp碱基, 并第3内含子处有222 bp重复序列的插入, 与所报道的突变体只在第2个外显子有343 bp碱基缺失的突变方式不同, 因此,是一个新的未见报道的基因等位突变体。对于中222 bp的插入序列, 该序列末端有17 bp的重复序列, 经序列检索比对分析发现, 222 bp序列为类逆转录转座子, 且在高粱、水稻、谷子等作物中均存在。我们检测到突变体中基因mRNA的表达量显著降低, 推测可能就是由于第2内含子的缺失以及第3内含子的222 bp插入序列, 导致了基因不能正常转录和剪切, 进而不能翻译成正常的VP1蛋白, 造成了其功能的缺失。综上,突变体的表型鉴定与基因克隆, 为进一步深入研究玉米基因的功能提供了新的实验材料。

4 结论

新发现一个玉米穗发芽突变体, 受单隐性核基因控制。中基因在第2内含子处缺失343 bp碱基, 在第3内含子处插入222 bp重复序列, 是基因的一个新等位突变体, 为探讨玉米穗发芽的分子机制提供了新的试材。

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Genetic analysis and causal gene identification of maize viviparous mutant

WANG Rui1,**, CHEN Yang-Song1,**, SUN Ming-Hao1,2, ZHANG Xiu-Yan3, DU Yi-Cong1, and ZHENG Jun1,*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin, China;3School of Life Science, China Agricultural University, Beijing 100193, China

The maize mutantshows clear viviparous phenotype and stable inheritance, and genetic analysis showed that the mutant phenotype was controlled by a single recessive gene. Using an F2segregation population derived fromand inbred line Zheng 58, the causal gene was mapped to an interval from 160.4 Mb to 165.6 Mb on chromosome 3 by the BSR-Seq technology. According to the maize genomic database, a previously discovered viviparous genewas identified to be in this mapping interval. The test crosses fromandheterozygous plants showed a 3:1 segregation ratio between normal and viviparous kernels. The genomic sequence analysis revealed thatmutant had a 343 bp deletion in the second intron and 222 bp insertion in the third intron ofgene, which is different frommutation of an only 343 bp deletion in the second intron ofgene. Further real time PCR analysis revealed that, compared with the normal kernels, the transcript level ofwas significantly decreased both inandviviparous kernels. Taken together, these evidences suggest thatis a new allele mutant of.

maize;; mutant;; gene mapping

2018-08-15;

2019-01-12;

2019-02-22.

10.3724/SP.J.1006.2019.83058

郑军, E-mail: zhengjun02@caas.cn

**同等贡献(Contributed equally to this work)

王瑞, E-mail: 18612261636@163.com; 陈阳松, E-mail: chenyangsong14@163.com

本研究由国家重点研发计划项目(2016YFD0101002)和中国农业科学院创新工程专项经费资助。

This work was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0101002) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190222.0900.002.html