22个Y-SNP在贵州满族人群的分布*

张秀秀， 国学红， 喻艳琴， 朱卫芳， 张 婷， 王婵娟， 单可人， 何 燕*， 吴昌学*

(1.贵州医科大学 地方病与少数民族疾病教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 贵州省医学分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 3.宿迁子渊司法鉴定所， 江苏 宿迁 223800)

按语言学分类满族属阿尔泰语系满-通古斯语族群，起源于东北最古老的民族肃慎[1]，其主体称谓经历了肃慎、挹娄、勿吉、靺鞨、女真和满族[2]。公元1644年，满族建立了清朝。清初，因平定明王朝残部反清势力和吴三桂叛清，清军两次入黔(公元1648年和1680年)，并于战后聚居在贵州毕节黔西、金沙、大方三县结合部[3]，400 余年来以“小聚居”形式与当地其他世居民族“大杂居”在一起。单核苷酸多态性(SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，且具有遗传稳定，灵敏度高等优点[4]。Y染色体非重组区SNP位点称为Y-SNP，在遗传学上同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合称为单倍型。在群体遗传学中，祖先单倍型与所有后代单倍型合称为一个单倍群，一个家族的所有 Y 染色体理论上都属于一个单倍群。Y 染色体单倍群具有人群和地理区域差异，在人类学的背景下，可推断未知样本的种族或地理来源[5-7]， 或人群进化、迁徙及相关历史活动[8]， 可有效评估群体的遗传结构[9]。因此，本文采用SNapShot法对70例贵州满族男性个体22个Y-SNP位点进行基因分型，探讨世居贵州满族人群的父系遗传特征，报告如下。

1 材料和方法

1.1 样本收集及 DNA 标化

根据知情同意原则，从课题组已经建立的贵州世居少数民族DNA样本库中，筛选出70例贵州满族男性DNA样本，入选标准为3 代内无族外通婚史，个体间无亲缘关系。每份DNA样本用Thermo ScientificTMNanoDrop Lite分光光度计定量后，取少量标化为20 mg/L作为实验的模板，-40 ℃保存备用。

1.2 Y染色体基因分型

1.2.1多重 PCR 扩增及提纯 依照国际系谱遗传协会(international society of genealogy,ISOGG)在网站 https://isogg.org/tree/index.html上发布的Y单倍群系统进化树，以其基本分支 C- O 及其亚簇为主, 筛选出 M145、RPS4Y711、M89、M9、M214、M175、M119、P31、M95、SRY465、47Z、M122、M324、P201、M159、M7、M134、M133、M217、M48、M407、P53.1共22个Y-SNP 为研究靶点，参考文献[10]分成 4 组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)进行 PCR 扩增(引物序列及分组情况见表 1)。体系包括20 mg/L的模板DNA 1.5 μL、引物 MIX 15 μL、10 nmol/L dNTP 3.0 μL、10×Buffer 2.5 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL、1 mmol/L甜菜碱 1.0 μL(其作用表现为富含 GC 模板的PCR扩增和提高 Taq DNA 聚合酶的稳定性)、5 mmol/L MgCl21.0 μL、500 mg/L 牛血清蛋白(BSA)0.5 μL。循环条件为95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循环 35 次；72 ℃ 7 min，产物置4 ℃保存。纯化：第Ⅰ、Ⅱ组PCR 产物各取1 μL混合，加入1 000 U/L虾碱酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)1 μL和1 000 U/L大肠杆菌核酸外切酶Ⅰ(exonuclease,ExoⅠ)1 μL，37 ℃ 70 min后75 ℃ 15 min，即得纯化后的多重 PCR产物，4 ℃保存，充当单碱基扩增时A组的模板。第Ⅲ、Ⅳ组扩增产物也如法纯化，充当单碱基扩增时 B 组的模板。

1.2.2SNapShot 单碱基扩增及纯化 分A、B两组进行单碱基扩增(分组情况及引物信息见表2)。体系包括模板 0.75 μL、SNapShot Mix 1.25 μL、单碱基扩增引物 MIX 0.5 μL。循环条件为96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循环 28 次，产物4 ℃保存。纯化：单碱基扩增产物加入1 000 U/L的SAP0.5 μL，混匀，瞬时离心，37 ℃ 70 min后75 ℃ 15 min灭活酶，即得纯化后的 SNapShot 单碱基延伸产物，4 ℃保存。

1.2.3ABI 3130 毛细管电泳检测 纯化的单碱基延伸产物0.5 μL、GeneScan-120LIZ Size Standard 0.05 μL 和 Hi-DiTM甲酰胺 9.45 μL，混匀、离心并用ABI 3130遗传分析仪(applied biosystems)进行毛细管电泳分析，ABI 3130 Genetic Analyzer Data Collection Software v3.0 进行数据收集。

1.3 数据统计分析

用直接计数法计算22个Y-SNP等位基因频率、单倍型频率与单倍群频率。单倍型多样性(HD)和基因多样性(genetic diversity，GD)根据公式HD或GD=n(1-ΣPi2)/(n-1)(Pi为单倍型频率或单倍型频率，n为样本数)计算。运用 SPSS 24 软件进行主成分分析(principle component analysis, PCA)，根据单倍群频率用 Arlequin3.5软件计算13个群体的遗传距离Fst值，MEGA 7.0软件根据Fst值用Neighbor-Joining法绘制系统进化树。

表1 筛选出的22个Y-SNP位点的多重PCR引物和SNapShot单碱基扩增引物Tab.1 The sequences of Multiplex PCR primers and SNapShot microsequencing primers for 22 SNPs on Y-chromosome

2 结果

2.1 贵州满族人群22个Y-SNP的遗传多态性

采用SNapShot法对贵州满族人群22个Y-SNP位点进行复合扩增检测，结果发现，所分析的22个Y-SNP位点中，P53.1位点较为特殊、测出结果均为C/T相同双峰，无多态性，因此仅纳入其它的21个Y-SNP位点进行分析，通过直接计数法获得其它的21个Y-SNP位点等位基因频率(图1)、基因多样性(图2)和单倍型频率(表2)，分析发现除了47Z、RPS4Y711、SRY465、M407、M159、M7、M217、M48位点没有多态性(GD=0.000 0)，其余13个SNP 位点均具有遗传多态性，Y-SNP突变频率为0.014 3～0.971 4、GD值为 0.028 6～0.492 3。22个Y-SNP位点单倍型共检出11种(其中有3个单倍型是唯一单倍型)，频率为0.014 3～0.371 4，HD值为0.740 4。依照国际系谱遗传(international society of genealogy,ISOG)网站https://isogg.org/tree/index. html 上发布的Y单倍群系统进化树进行单倍群的划分，通过直接计数法获得单倍群频率(见表3第1行)其中单倍群O*频率高达0.942 4。

图1 贵州满族人群21个Y-SNP的基因频率Fig.1 The frequencies of 21 Y-SNPs loci in Manchu population from Guizhou

图2 贵州满族人群21个Y-SNP的基因多样性Fig.2 Genetic diversity values of 21 Y-SNPs loci in Manchu population from Guizhou

表2 贵州满族人群21个Y-SNP组成的11种单倍型频率分布(n=70)Tab.2 11 haplotype frequency distribution of the 21 Y-SNPs loci in Manchu Population from Guizhou

2.2 贵州满族与12个少数民族的群体遗传学分析

2.2.1贵州满族与12个少数民族的主成分分析 将本次研究结果与已有文献报道的12个中国少数民族人群的单倍群频率进行比较(表3)，运用SPSS 24软件进行主成分分析(图3)，在主成分分析三维图上可以看到壮侗语族(水族、布依族、仫佬族)聚为一簇，苗瑶语族(畲族、苗族、瑶族)聚为一簇、满-通古斯语族(锡伯族、鄂伦春族、辽宁满族)与突厥语族(维吾尔、柯尔克孜族、哈萨克族)聚为一簇，而本研究的贵州满族单独为一簇。

2.2.2贵族满族与12个少数民族的系统进化树 贵州满族和中国12个少数民族人群间的Fst值分布情况见表4。基于13个人群单倍群分布频率用 Arlequin 3.5软件计算出群体间的遗传距离Fst值，结果显示13个群体间的Fst值为0.031 3～0.691 1，贵州满族与其他群体的Fst值介于0.162 8～0.497 2，其中贵州满族与新疆锡伯之间的遗传距离最小(0.162 8)，与内蒙鄂伦春族之间的遗传距离最大(0.497 2)，根据 13 个群体之间的遗传距离构建的系统进化树见图4。

图3 贵州满族和中国12个少数民族人群Y染色体主成分分析Fig.3 The principal component analysis of Y chromosome of Guizhou Manchu and 12 ethnic minority populations in China

表3 贵州满族和中国12个少数民族Y染色体单倍群频率Tab.3 Y-SNP haplotype frequencies of Manchu in Guizhou and 12 ethnic minority populations in China

表4 贵州满族和中国12个少数民族人群间的Fst值 Tab.4 Fst values of Guizhou Manchu and 12 ethnic minority populations in China

注：“+”为P<0.05，“-”为P≥0.05；对称轴上对应的P值，对称轴下是Fst值

图4 用邻接方法(NJ)构建的贵州满族和中国12个少数民族人群系统进化树Fig.4 The phylogenetic tree of Guizhou Manchu and 12 ethnic minority groups in China

3 讨论

为了探讨迁入并世居贵州的满族人群的父系遗传特征，本研究选择了Y染色体非编码区的22个Y-SNP 位点作为靶点，对70例贵州满族无关男性个体进行基因分型，并对结果进行相关统计分析。基因多样性分析结果显示，22个 Y-SNP位点中，P53.1位点测出结果均为双峰，可能是由于该位点所在片段在其他基因片段中有重复片段，Hueles等[13]在报道中称两峰现象是由于第一次扩增时产生了两种不同的扩增产物，而杜宏等[14]人推测该位点是被检测人群中的序列差异而出现双峰现象，究其原因还需进行进一步研究，其他21个Y-SNP位点均得到较好的分型结果，47Z、RPS4Y711、SRY465、M407、M159、M7、M217、P53.1、M48等9个Y-SNP 位点无多态性(GD=0.000 0)，具有遗传多态性的13个Y-SNP 位点的突变频率为 0.014 3～0.971 4，GD值为 0.028 6～0.492 3。21个Y-SNP位点所组成的单倍型共检出11种，频率为 0.014 3～0.371 4，HD 值为 0.740 4，可以看出 GD值和HD值都很低。影响群体遗传结构的因素有很多，包括人群的迁徙、自然环境、地理的隔离。提示贵州满族迁入贵州时人群数量有限，经过长期的迁移后到达新的领域适应新环境时容易发生遗传漂变，遵循适者生存原则，经过长时间的积累会出现奠基者效应。同时，由于贵州境内山峦起伏，地貌类型复杂，交通不便，相对封闭，与外界很少交流，导致Y-SNP的遗传多样性比原始民族低很多，因此可能出现瓶颈效应，导致贵州满族人群的GD值和HD值都很低。接下来对其进行单倍群相关性分析，O2a2b1与NO1(R=0.826，P=0.001)、O1a(R=0.723，P=0.005)、O1b(R=0.826，P=0.001)、O2a (R=0.826，P=0.001)为显著正相关。在本研究的贵州满族70个男性个体中，单倍群O*频率高达0.942 4，符合单倍群O*在中国人群中呈高频分布[15]。

为了说明贵州满族与其他民族间的关系，本研究选取了已有报道的中国不同语族的12个少数民族与贵州满族的单倍群频率进行主成分分析。在主成分分析三维图上可以看到壮侗语族(水族、布依族、仫佬族)聚为一簇，苗瑶语族(畲族、苗族、瑶族)聚为一簇、满-通古斯语族(锡伯族、鄂伦春族、辽宁满族)与突厥语族(维吾尔、柯尔克孜族、哈萨克族)聚为一簇，而本研究的贵州满族单独为一簇。从语言学上分类，贵州满族属于满-通古斯语族，从地理分布上来看，贵州满族已世居南方(贵州省)；但在主成分分析中，该人群既不与满-通古斯语族民族聚在一起，又不与贵州其他民族聚在一起，提示可能贵州满族从其起源地开始逐渐向外迁徙的同时，不断地与其他民族发生基因交流，进入贵州之后因为时间、语言、地理等原因虽与贵州其他少数民族发生基因交融，但仍然一定程度保留了本民族的基因特点，形成了独特的遗传结构。课题组前期对9个人群线粒体 DNA 的单倍群频率进行主成分分析显示，贵州满族与南方民族聚为一簇，母系和父系遗传标记得到结果并不一致[16]。推测从北方迁徙到贵州的满族可能主要是通过与当地其他民族的女性通婚，而子女则主要随父亲保留了满族的族源，从而形成了贵州满族人群在母系遗传上与当地民族发生了基因交融、而父系遗传结构则较大程度的保留了北方满族特性的群体遗传学特征。

根据13个人群单倍群计算出群体间的遗传距离Fst值，由遗传距离矩阵绘制遗传进化树。遗传距离矩阵显示贵州满族与其他少数民族均有统计学意义(P<0.05)，13个群体之间的Fst在0.031 3～0.691 1，贵州满族与其他群体的Fst值介于0.162 8～0.497 2，其中贵州满族与新疆锡伯族之间的遗传距离最小(0.162 8)，提示贵州满族与新疆锡伯族亲缘关系较近，这与百茹峰等[17]选择11个Y-STR基因座对24个群体的分子遗传学关系进行分析显示满族与锡伯族的遗传距离最小(0.012 4)的结果一致。在进化树的分析中壮侗语族聚为一支，然后与苗瑶语族聚为一大支，满-通古斯语族与突厥语族聚为一大支，贵州满族与新疆锡伯族聚为一支，进化树分析和主成分分析结果基本一致。

综上所述，从父系遗传结构分析，贵州满族既固有北方民族特点，又受到其他族群的影响，形成了父系独特的遗传特点，这与满族复杂的民族演化进程相符。