新疆地区不同绵羊品种支原体肺炎血清学调查

倪文浩 ，赵亚南 ，刘宜勇 ，吐来力江·哈木太 ，艾尔肯·艾沙 ，买力肯 ，曹 妍 ，玛依拉 ，陈 磊 *，李文蓉 *

（1.石河子大学动物科技科学院，新疆 石河子 832003；2.新疆畜牧科学院生物技术研究所，新疆 乌鲁木齐 830026；3.新疆巴音郭楞蒙古自治州种畜场，新疆 博湖县 841400；4.新疆伊犁州畜牧总站，新疆 伊宁 835000）

绵羊肺炎支原体（Mycop1asma ovipneumoniae of sheep）是引起绵羊或者山羊传染性胸膜肺炎又叫做绵羊支原体肺炎（Mycop1asma ovipneumoniae，MO）的病原体[1]。该病原体属于原核生物界支原体科支原体属，1963年首次由Mackay从绵羊体内分离得到，其后Cottew也在患间质性肺炎的澳大利亚绵羊肺脏中发现该病原，1972年Carmichea1等人证明了这种支原体的致病性[2]，并命名为绵羊肺炎支原体。该病多发生在枯草的冬季和早春季节，此时羊只因营养缺乏，机体抵抗力普遍降低，容易受寒感冒，羊只因此容易患支原体肺炎，且发病后致死率也很高。由于本病感染后常呈慢性表现，羊只即使康复也可长期带菌，造成该病的控制和消灭比较困难。近年来，随着新疆地区舍饲生产方式推广、集约化养殖技术广泛应用及各种国外绵羊新品种的引进[3]，加之新疆地区气候特点、规模化羊场因羊群高度集中饲养及羊群活动范围限制等因素，绵羊支原体肺炎的发病率和致死率有所上升，该病已成为危害绵羊养殖业的重要因素之一，对畜牧业发展造成了巨大经济损失。

绵羊支原体肺炎常呈现地域流行性，病原体主要通过飞沫传播，在寒冷潮湿、雨水不断、羊群拥挤、密集等环境因素下，对呼吸道的感染率较高[4]。1982年，胡景韶等人首次从国内发病绵羊体内分离到了该支原体，随后宁夏和新疆等地也分离到了该病原[5]。2005年以来，陶岳等开展了对新疆北疆石河子、沙湾、昌吉、奇台等地区绵羊肺炎支原体的血清学调查表明，绵羊肺炎支原体在上述地区广泛存在[6-10]，严重影响当地养羊业健康发展。为了解近年来绵羊肺炎支原体在新疆南北疆地区不同绵羊品种中的感染情况，2018年，我们采集了新疆伊犁与巴州地区未免疫MO疫苗的4种绵羊品种血清样本进行血清MO抗体和抗原成分的检测及分析，为新疆地区绵羊支原体肺炎的防控提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

绵羊肺炎支原体抗体（Sheep MP Ab，以下简称MP-Ab）、绵羊肺炎支原体抗原（sheep MP Ag，以下简称MP-Ag）ELISA试剂盒购自TSZ（美国），离心机购自德国艾本德，ZHWY-2102C型恒温培养振荡器购自上海智城分析仪器制造有限公司，3001-1311型酶标仪购自赛默飞世有限公司；DHP-420恒温培养箱购自北京市永光明医疗器械厂，其他所用试剂耗材（如采血管等）均为国产试剂。

1.2 血样收集与处理

2018年4月至5月在新疆伊犁和巴州地区两个规模化羊场，随机采集2～3岁年龄绵羊血清，共1 628份（样品信息参见表1）。使用非抗凝真空采血管采集新鲜静脉液，于4℃冰箱静置30 min，待其自然凝集，收集析出上清。将其中溶血现象血液样品进行离心10 min（3 000～4 000 r/min），仔细收集上清。收集的血清进行标记、记录羊号，而后放置-80℃冰箱保存备用。

1.3 Sheep MP抗原抗体ELISA检测

1.3.1 Sheep MP抗体检测

参照Sheep MP Ab试剂盒说明书进行血清MO抗体水平的定性定量分析：该试剂盒采用间接ELISA方法，用MO抗原包板。具体操作：将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、阳性对照2孔。分别在阴、阳性对照孔中加入阴性标准对照、阳性标准对照50 μL。然后在待检样品孔中依次分别加入40 μL样品稀释液、10 μL待测血清样品。轻轻摇匀，盖上封板膜，置于37℃温箱培养箱孵育30 min。随后揭开封板膜，甩干液体，拍干后用30倍稀释的洗液洗涤，重复洗涤5次。加入酶标二抗50 μL后，再次放置温箱温育30 min。孵育后的洗涤步骤同上。接着，每孔现加入显色剂A 50 μL、再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃温箱内避光显色15 min。最后，每孔加入终止液50 μL，终止反应。将酶标版放置至450nm波长酶标仪中测定OD450nm值。结果判定：试验的有效性为设置阳性对照孔平均值≥1.00，设置阴性对照平均值≤0.10；临界值=设置阴性对照孔平均值+0.15。其中，样品OD值＜临界值(CUT OFF)者为绵羊肺炎支原体(MO)阴性，样品OD值≥临界值(CUT OFF)者为MO阳性。

1.3.2 Sheep MP抗原检测

参照Sheep MP Ag试剂盒说明书进行血清MO抗原水平的定性定量分析：该试剂盒采用双抗体夹心ELISA方法，用MO抗体包板。具体操作：将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、阳性对照2孔。分别在阴、阳性对照孔中加入阴性标准对照、阳性标准对照抗原50 μL。然后在待检样品孔中依次分别加入40 μL样品稀释液、10 μL待测（抗原）血清样品。轻轻摇匀，盖上封板膜，置于37℃温箱培养箱孵育30 min。随后揭开封板膜，甩干液体，拍干后用30倍稀释的洗液洗涤，重复洗涤5次。加入酶标抗体50 μL后，再次放置温箱温育30 min。孵育后的洗涤步骤同上。接着，每孔现加入显色剂A 50 μL、再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃温箱内避光显色15 min。最后，每孔加入终止液50 μL，终止反应。将酶标版放置至450nm波长酶标仪中测定OD450nm值。结果判定：试验的有效性为设置阳性对照孔平均值≥1.00，设置阴性对照平均值≤0.10；临界值=设置阴性对照孔平均值+0.15。其中，样品OD值＜临界值(CUT OFF)者为绵羊肺炎支原体(MO)阴性，样品OD值≥临界值(CUT OFF)者为MO阳性。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，采用卡方检验进行差异显著性比较，以P＜0.05表示差异显著，用不同小写字母表示；以P＜0.01表示差异极显著，用不同大写字母表示。

2 结 果

2.1 血样收集

采集的新疆伊犁和巴州地区规模化羊场绵羊血清共1 628份，见表1。

表1 新疆伊犁地区和巴州地区规模化羊场绵羊血清样品情况

2.2 Sheep MP抗原、抗体ELISA检测结果

新疆伊犁和巴州地区羊场不同绵羊品种血清中MP-Ab和MP-Ag ELISA检测结果如表2所示，不同地区绵羊品种间均检测到MP-Ag和MP-Ab。其中，伊犁地区MP-Ag平均阳性率20.29%与MP-Ab平均阳性率16.62%均高于巴州地区MP-Ag平均阳性率14.42%与MP-Ab平均阳性率14.65%，但差异不显著（P＞0.05)。伊犁地区哈萨克羊、萨福克羊的MP-Ag阳性率分别为20.04%、20.61%，巴州地区巴音布鲁克羊、杜泊羊、萨福克羊MP-Ag阳性率分别为17.91%、11.08%、14.70%，同一地区不同绵羊品种的MP-Ag阳性率虽有差异，但差异不显著。 伊犁地区哈萨克羊MP-Ab阳性率23.22%极显著高于萨福克羊MPAb阳性率8.30%（P＜0.01)，巴州地区巴音布鲁克羊MP-Ab阳性率18.65%显著高于杜泊羊MP-Ab阳性率11.08%（P＜0.05），也高于萨福克羊MP-Ab阳性率13.32%，但差异不显著（P＞0.05）。说明不同绵羊品种之间MP-Ab检出阳性率存在差异。

表2 伊犁、巴州地区羊场不同品种绵羊血清中MP-Ab和MP-Ag ELISA检测结果

3 讨 论

绵羊支原体肺炎是由肺炎支原体感染而诱发的一种急性、热性和高度传染性的疾病，其临床特征是高热、咳嗽，肺和胸膜发生浆液性及纤维素性炎症[11]。除急性发病外，该病原可长期存在于动物体内，导致部分病羊渐进性消瘦，怀孕母羊感染还易引发流产，羔羊感染死亡率较高。绵羊肺炎支原体流行广泛，致病力强，病羊是主要传染源。病原体主要通过呼吸道分泌物排出体外，经空气-飞沫传播[12]，耐过病羊在相当长时间内带毒，有传播病原的危险性。由于该病对青霉素类药物具有抗性，且容易对四环素和大环内酯类药物产生耐药性，所以对绵羊支原体肺炎的抗生素治疗效果不佳。此外，绵羊支原体疫苗的保护作用较弱[13]，对该病的防控带来很大困难，对养羊业危害严重。

绵羊肺炎支原体是国内绵羊、山羊和大角羊最常见的分离病原体之一，可引起羊的原发性非典型肺炎[14]。Rong et a1.(2014)通过绵羊肺炎支原体血清学调查研究了中国热带地区的山羊，检出阳性率高达31.7%[15]，青海省（2009年）阳性率 30.40%。在本研究中，对新疆伊犁、巴州地区不同绵羊品种进行血清学检测，调查了绵羊支原体肺炎感染情况，结果显示绵羊支原体肺炎的总抗体阳性率平均达到15.54%。这与李劼等报道的新疆石河子地区（2005年）湖羊MO抗体阳性率 77.90%、新疆阿勒泰（2012年）阳性率22.20%相比，抗体阳性率较低。一方面，这可能是外来引进绵羊适应新疆环境的能力较弱，感染该病且发病致死率高，不同年龄的羊只感染该病的情况不同有关，本研究所涉及羊只均为2～3岁龄的成年羊。解慧梅等[16](2015)对泰州地区36家羊场开展绵羊支原体肺炎流行病学调查，得到3月龄以下的羔羊发病率为45%、致死率为95%，明显高于其它年龄阶段的羔羊、成年羊。马玉等[17]（2015）对沙湾县调查的7个乡镇的18个绵羊养殖场中，0～3月龄羔羊的临床疑似绵羊支原体肺炎所占比例最高达68.57%，明显高于3～12月龄（27.78%）和12月龄以上（19.66%）的绵羊。本研究的血清样品为2～3岁龄的成年羊，其抗体检出阳性率为8.30%～23.22%，与马玉对沙湾县12月龄以上绵羊MP抗体阳性检出率19.66%的研究结果相似。不同年龄阶段的绵羊对绵羊支原体肺炎的感染率不同，也说明防治绵羊支原体肺炎在羔羊时期应早发现早治疗。

张道永等[18]（1998）在羊霉形体的研究中提到，不同品种的羊对绵羊支原体肺炎的易感性差异较大，进口种羊比本地羊易感。马玉等[18]对新疆沙湾县乡镇绵羊养殖场进行了血清MO抗体水平检测，得出湖羊抗体阳性率（85.71%）远高于阿勒泰羊（48.15%）和小尾寒羊（57.14%）。Chen C等采用间接血凝测定法分析了中国新疆六个地区四个不同品种羊（哈萨克羊、湖羊、美利奴羊和多浪羊）1 679份血清等样本，结果表明四个品种绵羊的抗体阳性率在9.76%和30.61%之间，湖羊明显高于其他品种。本次试验中，伊犁地区MP-Ab平均阳性率16.62%高于巴州地区MP-Ab平均阳性率14.65%，但差异不显著（P＞0.05)；绵羊品种间MP-Ab检出的阳性率存在显著性差异，分别在南北疆选择的两个试验点的不同品种间MP-Ab检出的阳性率均呈现显著性差异。哈萨克羊与巴音布鲁克羊为新疆本地绵羊品种，杜泊羊与萨福克羊为外来引进品种。在本地品种MP-Ab检出的阳性率均显著高于相同羊场饲养的外来引进品种，即哈萨克羊23.22%vs萨福克8.3%（P＜0.01）、巴音布鲁克羊18.65%vs杜泊羊11.08%(P＜0.05)(表2)。尽管感染支原体量的多少、感染时间的长短、所处病理时期等因素均可能影响MP-Ab水平，对MP-Ab检出结果产生一定偏差，但是目前的初步结果提示，不同绵羊品种对该病感染的应答存在一定差异。本地羊适应新疆的自然环境和气候，并始终坚持自繁自养，虽然MP抗体、抗原阳性检出率高，但感染该病后死亡率不高。在实地调查过程中，我们也观察到本地品种羊只中表现咳嗽等发病症状的情况低于引进绵羊品种。提示，新疆引入绵羊品种与本地品种均可感染该病，但是该病在不同品种绵羊发病率可能存在差异。相关研究有待进一步展开。

伊犁地区萨福克羊MP-Ag阳性率20.61%，与哈萨克羊MP-Ag阳性率20.04%相似。在巴州地区，巴音布鲁克羊MP-Ag阳性率17.91%高于杜泊羊MP-Ag阳性率11.08%与萨福克羊MP-Ag阳性率14.70%，但差异不显著（P＞0.05）。这可能因为杜泊羊与萨福克羊在0～3月龄的羔羊感染了绵羊支原体肺炎，发病后致死率高于新疆本地绵羊，也有可能通过屠宰等方式淘汰患病羊，造成群体中感染该病的患病羊只数量减少，导致各试验群体中MP-Ag检出阳性率并未呈现没有显著性差异。本次试验中，我们对引进到伊犁地区和巴州地区的萨福克羊MP抗原抗体检出率进行比较，伊犁地区萨福克羊MP-Ag阳性率20.61%高于巴州地区萨福克羊14.70%，差异不显著（P＞0.05），伊犁地区萨福克羊MP-Ab阳性率8.30%低于巴州地区萨福克羊13.23%，差异不显著（P＞0.05）。说明，在新疆南北疆不同地区规模化羊场的养殖环境下，引进品种均可感染绵羊支原体。

通过对新疆地区不同绵羊品种绵羊支原体肺炎血清学调查，了解了伊犁地区与巴州地区绵羊支原体肺炎的感染情况，证实了其绵羊感染支原体肺炎十分普遍，初步掌握了南北疆该病在当地品种和引进品种绵羊感染情况。研究表明，定期对规模化养殖场羊群、山区牧民羊群以及乡村农户羊群进行绵羊支原体肺炎的排查，为两地区绵羊支原体肺炎的科学防控提供血清流行病学依据，减少新疆养羊业的经济损失。