轻度认知功能障碍患者的肠道菌群特征☆

曾秀丽 谭楚红 吴齐恒 何彦 尹恝 朱佳佳

轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment,MCI）是介于正常衰老与轻度痴呆的一种病理状态[1]。中国老年人群中MCI患病率高达20.8%[2]，且以每年增加15.0%的速度转化为痴呆。MCI患者转化成痴呆的风险比普通老年人高了近10倍[3]。研究表明，肠道菌群可能在认知功能障碍的发生发展中起着重要作用[4-5]。然而目前的研究多基于PAP转基因痴呆型小鼠，且研究结果不一致[6-8]。基于人群的研究有限，且报告均来自其他国家[9-10]。因此本研究拟在社区招募健康的中老年人，通过对受试者进行认知功能、肠道菌群及相关指标的检测，进而初步探究轻度认知功能障碍患者的危险因素和菌群特征。

1 对象与方法

1.1 研究对象受试者来源于2016年12月至2017年1月在广东省广州市农垦总局老干所和燕岭医院社区开展的卒中风险筛查项目。入组标准：①年龄50岁以上；②日常生活完全自理；③客观认知功能受损[11]：蒙特利尔认知评估基础量表（Montreal cognitive assessment-basic，MoCA-B）的分界值为：学历低于6年，≤19分；学历7～12年，≤22分；学历超过12年，≤24分；④临床痴呆评定量表（clinical dementia rating,CDR）＜0.5 分；⑤广州居住时间超过3年，每年超过10个月，近期无跨境旅游。排除标准：①临床诊断为痴呆（阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）、血管性痴呆等）；②有影响认知功能评估的疾病或无法配合（视力、听力障碍；焦虑、抑郁状态或治疗状态）；③既往心脑血管疾病史（脑出血、脑卒中、急性心肌梗死等）；④3个月内口服抗生素、益生菌和（或）益生元。本研究遵循赫尔辛基宣言，获得了南方医科大学南方医院伦理委员会的批准 （伦理批准号：NFEC-2016-148），征得了受试者本人的同意并签署知情同意书。本研究共纳入了93例受试者，并分成两组：轻度认知功能障碍组 （mild cognitive impairment,MCI）和对照组（normal cognitive,NC），采集受试者的空腹抗凝血和新鲜粪便样本。

1.2 粪便总DNA提取、PCR扩增和测序新鲜粪便样本在采集后4 h内冻存在-80℃冰箱。200 mg粪便样本使用磁珠法进行粪便细菌总DNA的提取（粪便样本总DNA磁珠法提取试剂盒，深圳易瑞生物技术有限公司）。通过罗氏480定量qPCR仪扩增细菌16S rRNA的V4可变区。将PCR产物等浓度混匀后纯化，送广州美格生物科技有限公司进行16S rRNA测序。

1.3 数据采集研究采用问卷调查的形式记录基础数据。10年缺血性心血管病评分（ischemic cardiovascular disease,ICVD）[12]用于综合评价长期心血管疾病风险。MoCA BC是一种可靠的认知筛查测试，在国内老年人群中具有较高的可接受性和较好的信度[11]，由经过培训的神经内科医师进行评估。两名有经验的医生通过二维B型超声仪器（美国通用电气公司）获取颈动脉超声数据：双侧颈总动脉的内膜中层厚度和斑块的性质（回声、数量、大小）。将所测得的所有独立斑块厚度相加后得到的数值即为Crouse积分，可简单量化颈动脉粥样硬化的严重程度。常规的生化指标（如肝肾功能等）送南方医院检验科检测。通过气相色谱法检测粪便中短链脂肪酸 （short-chain fatty acid,SCFA） 浓度。血浆内毒素（lipopolysaccharide,LPS）、内毒素结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein,LBP）、D-乳酸 （D-Lactic Acid,D-LA）和肠型脂肪酸结合蛋白 （intestinal fatty acid binding protein,iFABP）浓度由酶联免疫吸附法测定，检测试剂盒购于广州昂飞生物科技有限公司。血浆炎症因子由液相芯片法测定，检测试剂盒购于上海优宁维生物科技股份有限公司。

1.4 生物信息获取与统计研究人员在QIIME平台对原始测序序列进行质控和去嵌合，以供后续的菌群分析与统计。菌群的多样性指标分为α多样性和β多样性。前者是指样本内的物种多样性，常用指标有：系统发育多样性指数（phylogenetic diversity whole tree，PD whole tree） 和 Shannon 指数。后者反映样本间的物种多样性差异。Bray-Curtis距离是基于可分类的操作单元（operational taxonomic units,OTUs）的计数统计，本研究采用Bray-Curtis距离矩阵来展示不同样本之间的β多样性差异。而主坐标分析 （principal coordinates analysis,PCoA）可使距离矩阵降纬成可视化的三维立体图形。样本间的距离表示样本间的差异来源，组间多样性差异的显著性由Adonis检验来确定，检验水准α=0.05。

本研究采用线性判别效应分析 （linear discriminant analysis effect size,LefSe）[13]来展示两组之间的差异菌群。LEfSe分析是基于Wilcoxon秩和检验来挑选组间的差异菌属，并计算不同菌属的效应值大小，效应值≥2.0的细菌通常被认为差异显著。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0进行数据分析，非正态分布连续变量采用中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；分类变量比较采用χ2检验。采用单因素logistic回归分析，挑选出P＜0.05的变量为差异变量。将年龄、性别、教育水平作为混杂因素对有统计差异的变量进行校正。采用forward和backward的方法将上述变量纳入多因素logistic回归模型，得到最具有差异的因子。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况与菌群代谢、肠道屏障、炎症因子检测93例受试者中，MCI组28例，平均年龄66.3岁，男13例。NC组65例，平均年龄61.7岁，男26例。两组人群的一般情况 （年龄、性别和教育水平）、生活方式（如吸烟、饮酒、饮食习惯、是否缺乏体育锻炼、排便是否顺畅）、既往病史（如高血压、糖尿病）等均无统计学差异（P＞0.05）。血浆内促炎因子（如 TNFα、IFN γ、IL-1β、IL-6、IL-22 等）、抗炎因子IL-4及反映内皮细胞功能 （如MMP9、VEGF-A、CD138、ICAM-1、E-Selectin 等）等指标，两组比较均无统计学差异（P＞0.05）。此外，MCI组的粪便内SCFA，如乙酸、丙酸、丁酸等浓度较低，但无统计学差异（P＞0.05）。 血浆 LPS、LBP、D-LA、iFABP是反映肠道屏障的常用指标，两组比较也未见统计学差异（P＞0.05）。

2.2 MCI患者的肠道菌群特征与NC组相比，MCI组的菌群α多样性稍高，但无统计学差异（P＞0.05）（图 1A-B）。 基于 Bray-Curtis距离的 β多样性分析显示，MCI组和NC组之间的肠道菌群构成存在显著差异（P=0.03,Adonis test,图1C）。门水平（图1E）和科水平（图1F）的菌群构成图表示的是两组之间的菌群平均丰度变化。进一步的LEfSe分析显示，MCI组的肠道内变形菌门、厚壁菌门、互养菌门丰度增加，主要表现为变形菌门下的肠杆菌科、氨基酸球菌科，厚壁菌门下的乳酸杆菌科，互养菌门的互养菌属等细菌的富集 （图1D）。

2.3 MCI危险因素分析单因素logistic回归分析（表 1） 提示， 年龄 （OR=1.056，P=0.029）、 肌酐（OR=1.036，P=0.016）、动脉粥样硬化指标（如内膜中层平均厚度、Crouse积分和不同性质的斑块数量等）均与认知功能障碍相关（P＜0.05）。此外，变形菌门及其下的变形菌纲、肠杆菌科、氨基酸球菌、乳酸杆菌科及其下的乳酸杆菌也是MCI的潜在危险因子（P＜0.05）。校正年龄、性别、教育水平等混杂因素后，Crouse积分、高回声斑块数量、斑块总数量等动粥指标及变形菌门、乳酸杆菌等细菌丰度仍与MCI相关有统计学意义（P＜0.05）。纳入上述变量的多因素logistic回归分析提示，高回声斑块数量（B=2.443,OR=11.511,95%CI：1.406～94.226,P=0.023）和乳酸杆菌高丰度（B=1.588,OR=4.894,95%CI：1.090～21.966,P=0.038）与 MCI关联有统计学意义。

3 讨论

本研究表明，和认知功能正常患者相比，轻度认知功能障碍患者的菌群特征主要表现为变形菌门及其下的肠杆菌科和乳酸杆菌科的富集。在健康成人的肠道中只占小部分[14]的变形菌门，其丰度一旦过度增长会使内部固有菌群抵抗外来病原菌定殖的能力下降，进一步促进炎症反应和病原体入侵。因此，变形菌门的富集也被认为是一种肠道菌群紊乱的标志，具有潜在的疾病诊断价值[15]。来自意大利的一项研究发现，MCI患者肠道内的变形菌门下的细菌大肠杆菌或志贺氏杆菌的相对丰度增加[10]，这与本研究结果基本一致。两个研究的主要区别是前者采用qPCR方法检测患者肠道菌群中的几种常见细菌的相对丰度，而后者则使用16S rRNA测序的方法评估了患者肠道内菌群，肠屏障和代谢情况，研究的方法和侧重点有所不同。但是两个研究的结果都提示MCI患者肠道内潜在致病的变形菌门的富集。

乳酸杆菌被认为是传统的有益菌，在特定细菌的作用下能将乳酸转化成具有抗炎作用的丁酸等SCFA[16-17]。国外的研究发现，乳酸杆菌干预可以改善AD患者的认知[18]。然而，研究者对肠道内乳酸杆菌的作用仍持有争议。一系列临床研究发现，乳酸杆菌在心脑血管疾病相关的人群[19-21]的肠道或血液内富集。在本研究中，MCI患者肠道内乳酸杆菌丰度较高，而且这种显著性经多因素logistic回归分析后依旧存在。肠道内产丁酸菌和丁酸盐浓度的下降，往往伴随着产乳酸菌的升高[22-23]，两类细菌似乎存在着拮抗作用。研究发现，AD小鼠的粪便和脑组织SCFA浓度下降[24]，而丁酸盐干预能改善小鼠的认知[25]，这提示肠道代谢产物SCFA浓度降低与认知受损有关。肠道内乳酸杆菌升高导致的短链脂肪酸生成减少可能是导致轻度认知功能障碍的潜在机制。本研究中的认知轻度受损患者，虽然肠道菌群构成已经出现了早期的改变，粪便SCFA水平较低，但是菌群代谢、肠道屏障、外周炎症、内皮细胞功能等指标无统计学差异。乳酸杆菌在MCI的发生发展中扮演的角色仍需要深入研究。

图1 MCI组和NC组的菌群差异比较。A：菌群系统发育多样性；B：Shannon指数；C：基于Bray-Curtis距离的β多样性三维PCoA图，每一个点代表一个样本，坐标轴下的数值代表对差异的解释度；D：两组LEfSe结果差异分类群及其效应值大小(LDA≥ 2.0的分类群)；E：两组菌群门水平构成相对丰度饼图；F：两组菌群科水平的菌群构成饼图，不同的颜色代表不同的肠道细菌

表1 MCI危险因素的单因素logistic回归分析

在单因素逻辑回归分析中，颈总动脉内膜中层厚度、Crouse积分、斑块数量与认知功能障碍有较强的相关性。研究表明，CCAIMT与无症状颈动脉粥样硬化患者的认知功能减退相关[26]，这与我们的研究结果基本一致。此外，CCAIMT可以预测认知功能减退的进展[27]，提高MCI向痴呆转化的风险[28]。斑块数量是评估动脉硬化最简单方便的指标。本研究发现不同性质的斑块数量是MCI的危险因素。经多元逻辑回归分析，高回声斑块数量仍具有较显著的相关性。因此，在面对合并多个稳定斑块的颈动脉硬化患者，临床医生需考虑对患者进行早期的认知评估。

综上所述，本研究表明，MCI患者的菌群特征为变形菌门、互养菌门和乳酸杆菌的富集。肠道内乳酸杆菌高丰度及多发高回声斑块是MCI的可能危险因素。鉴于本研究对象研究样本量较少，且缺乏长期的随访，轻度认知功能障碍患者的菌群特征仍需大样本研究进一步验证。