基于二茂铁标记的电化学DNA生物传感器研究*

朱济锋， 王国东， 周大明， 王赟姣， 梁丽媛, Chaker TLILI

(1.河南理工大学 电气工程与自动化学院，河南 焦作 454150；2.河南理工大学 物理与电子信息学院，河南 焦作 454150；3.中国科学院 重庆绿色智能技术研究院精准医疗单分子诊断中心，重庆 400700)

0 引 言

近年来，发展检测特异性脱氧核糖核酸(DNA)的生物传感装置引起了广大科研工作者的兴趣[1～3]。在过去的几十年里，已开发出多种DNA生物标志物的检测技术，如聚合酶反应(polymerase chain reaction,PCR)[4]、微阵列荧光技术[5]和比色测定[6]等。然而，这些技术由于存在过程耗时长、标记步骤繁琐、价格昂贵等缺点，很难大规模推广应用。较之传统的检测方法，电化学生物传感器不仅灵敏度高、选择性好、成本低廉，还具有小型化的前景，非常适合规模化生产，是公认的最有前景的生物标志物快速检测方法[7]。目前，基于电化学的无指示剂DNA生物传感器引起了广泛关注和研究兴趣，这类传感器通过键合在DNA探针上的电活性基团电化学信号的变化，实现对目标的快速、灵敏检测。

几十年来，基于电化学的DNA生物传感器已在疾病诊断、基因测序、食品安全、环境检测等领域开展了大量的基础研究，但在稳定性、选择性和可重复性方面仍面临一定的挑战，限制了其在临床诊断中的大规模应用。

本文利用二茂铁及其衍生物可逆性强、再生电位低且氧化还原态稳定的特点[8,9]，在金电极上通过Au-S键自组装方式固定巯基和二茂铁修饰的DNA探针，构建了基于二茂铁为电子介体的具有重复性强、稳定性和选择性好的电化学DNA传感器。

1 基本原理

传感器的基本原理如图1所示。首先，修饰有巯基和二茂铁的DNA探针通过Au-S键在金电极表面自组装形成均匀分布的目标DNA捕获区，由于DNA探针上的二茂铁与金电极表面距离较近从而产生一个相对较大的峰电流信号，当加入目标DNA后，DNA探针与目标DNA杂化形成刚度较大的DNA双链，从而使DNA探针尾端的二茂铁远离金电极表面，使得方波伏安法中的峰电流减小,构建“tun-off”型电化学传感器[10～12]。同时，有研究者指出“茎环形”DNA传感器和“直线形”DNA传感器在使用交流伏安(AC voltammetry,ACV)法、循环伏安(cyclic voltammetry,CV)法和差分脉冲(differential pulse voltammetry,DPV)法检测时，由于扫描频率的不同而出现由“tun-off”转变为“turn-on”型的DNA传感器[13]。因此，本文重点考查了方波伏安法的扫描频率对DNA传感器的检测灵敏度影响，优化基于二茂铁电子介体的电化学DNA生物传感器性能。

图1 生物传感器原理

2 实 验

2.1 仪器与试剂

本文电化学实验均采用三电极系统：工作电极为金电极(直径为2.0 mm),铂丝为辅助电极，饱和Ag/AgCl作为参比电极。方波伏安法(square wave voltammetry,SWV)测定均使用CHI760E 电化学分析仪(上海辰华仪器有限公司)；实验中所设计的不同序列DNA均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下：

探针Fc-DNA(3′-HS-C6-TTT-TTT-TTT-TAT-GGG-ACA-TCT-GGT-TTC-AAA-CAC-Fc-5′)

完全互补 cDNA (5′-TA-CCC-TGT-AGA-ACC-GAA-TTT-GTG-3′)

完全不互补ncDNA (5′-AT-AAT-CTC-GTG-TAT-ACC-AAA-TGT-3′)

2.2 金电极预处理

首先将金电极用砂纸打磨，然后分别使用1，0.3，0.5 μm的氧化铝粉末对金电极进行抛光，直到电极表面光滑如镜，并分别使用超纯水和乙醇超声清洗残留的氧化铝。然后在食人鱼溶液(V(H2SO4)︰V(H2O2) =7︰3)中超声清洗5 min后再用超纯水清洗。将清洗后的电极放入0.1 mol/L硫酸溶液中使用电化学工作站在-0.2～2 V的电压范围内以100 mV/s的速率连续扫描直到曲线稳定。最后，使用超纯水超声清洗，并用高纯氮气吹干备用。

2.3 传感器的制备

取二茂铁和巯基修饰的探针Fc-DNA溶液(20 μmol/L)10 μL,加入20 μL的三(2—羧乙基)磷盐酸盐(TCEP,100 mmol/L)，和170 μL的Tris缓冲溶液(10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4；1 mol/L NaCl),在 37 ℃条件下反应20 min激活DNA探针上的硫醇基团(SH)。然后将预处理过的裸金电极浸没在上述Fc-DNA探针混合溶液中静置过夜，使Fc-DNA探针在金电极表面自组装形成均匀分布的目标DNA捕获区。待Fc-DNA探针固定后，用超纯水冲洗去除不稳定的Fc-DNA探针，然后将电极浸没在1 mmol/L的巯基乙醇(MCH)溶液中4 h以封闭金电极裸露表面，最后用Tris缓冲液冲洗可以得到DNA检测传感器。

2.4 电化学检测

在室温条件下，将修饰过Fc-DNA探针的传感器分别与不同浓度的目标DNA反应1 h。然后在三电极系统中，采用方波伏安法在磷酸缓冲溶液(10 mmol/L PBS，pH 7.4)中进行检测，检测电压范围为0.25～0.6 V，扫描频率为200 Hz。通过对比DNA传感器与目标DNA杂交前后，峰电流的变化率ΔIP/I0(%)来检测目标DNA的浓度，其中，ΔIP=I0-IP,I0为未加入目标DNA前金电极的峰电流，IP为加入目标DNA后金电极的峰电流。

3 结果与讨论

3.1 金电极电化学表征

图2 金电极电化学表征

3.2 频率分析

在方波伏安法中当扫描频率远低于二茂铁电子介体传输速率时，峰电流与频率成正比。如图3(a)所示，当扫描频率在低于200 Hz时，不同扫描频率的峰电流呈线性关系，在DNA杂化之前，其线性拟合公式为Is=0.040 7+3.903 4f,Is为DNA杂化前的峰电流，f为扫描频率，线性相关系数为0.989 7。在DNA杂化后，其线性拟合公式为ID=0.040 7+3.903 4f,ID为DNA杂化后的峰电流，f为扫描频率，线性相关系数为0.88。而当施加的频率接近临界值时，电子转移无法跟上快速振荡的电位，峰电流相对于背景电流减小。如图3(b)所示， 当扫描频率高于200 Hz 时，杂化前的峰电流相对于杂化后的峰电流的变化率减小[13]。

图3 频率分析

所以，在本文中选取最佳的扫描频率200 Hz进行方波伏安法检测。

3.3 检测性能

为了检测制备的DNA传感器性能，使用方波伏安法对不同浓度的目标DNA进行检测，可以看出，随着目标DNA浓度从0 nmol/L增加至100 nmol/L，峰电流逐渐降低，由于Fc-DNA探针与目标DNA杂化形成了刚度较大的DNA双链，使得Fc-DNA探针末端修饰的二茂铁远离金电极表面，这与设计的检测原理一致。在目标DNA杂化前后峰电流变化率ΔIP/I0(%)与目标DNA浓度线性关系中，误差棒由3个独立重复的实验计算所得。峰电流变化的信号量与加入的目标DNA浓度在5.0×10-9～1.0×10-7mol/L范围内呈线性关系，其线性方程式为ΔIP/I0(%) =0.760 95+0.610 65c，ΔIP/I0(%)为峰电流的相对变化率，c为目标DNA的浓度，线性相关系数为0.993 54。采用3σ计算方式，其检测限为1.7×10-9mol/L。

3.4 选择性

在相同条件下，对100 nmol/L非互补DNA(ncDNA)和互补DNA(cDNA)进行了检测，结果如图4所示。从图4(a)可以看出：当ncDNA与DNA探针反应后，由于两个DNA单链无法互补，所以杂化后峰电流基本不变，当与cDNA序列杂化后，由于符合碱基互补配对原则，形成了刚度较大的双链DNA后将末端的电化学活性基团二茂铁从金电极表面拉远，使得峰电流下降，表现出明显的响应电流变化。从图4(b)的峰电流变化柱状图可以看出，加入nc-DNA后其峰电流变化率为0.2 %，而相同浓度下的cDNA所引起的峰电流变化率为59.9 %，说明制备的电化学DNA生物传感器拥有良好的选择性。

图4 选择性测试

3.5 稳定性与重现性

为了检测所制备传感器的稳定性，将修饰过探针的DNA传感器浸没在Tris缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.4；150 mmol/L NaCl；20 mmol/L MgCl2)中，在室温条件下分别放置1,24 h后检测其方波伏安曲线，其峰电流分别减小0.1 %和1.4 %，说明所构建的DNA传感器具有良好的稳定性。

在相同的条件下，独立构建3支不同的DNA传感器，在同等的条件下与100 nmol/L的互补DNA杂化反应后，3支DNA传感器的峰电流变化率依次为54 %，56.3 %，60 %，RSD为4.3 %，表明了良好的重现性。

4 结 论

本文构建的传感器利用Au-S键的自组装作用，通过在DNA两端分别标记二茂铁和巯基，避免了繁琐的修饰过程；通过对方波伏安法扫描频率与峰电流信号之间关系的优化，极大地提高了DNA电化学生物传感器的检测灵敏度和稳定性。此外，该传感器适合用于快速、灵敏的检测特异性DNA，本文有望为后续的临床早期诊断疾病中检测变异的DNA序列提供理论依据和参考。