柱前衍生化反相高效液相色谱法测定去水卫矛醇的含量*

王杏利，孙丽涵，张雷，吴华晶，张峻颖，吴春勇

(1.中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，南京 210009；2.中国药科大学中药制剂系，南京 211198；3.中国药科大学药物分析系，南京 210009；4.山东省食品药品检验研究院，济南 250101)

去水卫矛醇(dianhydrogalactitol)是以卫矛科植物蜜花美登木中提取的卫矛醇为原料，经溴化、消除等反应得到的细胞周期非特异性抗肿瘤药物[1]，可在肿瘤组织中优先蓄积[2]，具有毒性小的优点[3]，对慢性粒细胞白血病及多种肿瘤均有良好疗效[4-5]。除单独使用外，去水卫矛醇还可与其他药物联合使用，并发挥协同作用[6]。去水卫矛醇具有中枢神经系统活性，可跨血-脑屏障进入脑部[7]，使胶质瘤细胞增殖停滞在细胞周期的G2/M期，从而抑制其生长[8]。作为一种潜在的多靶点药物，去水卫矛醇作为治疗胶质瘤的孤儿药已在美国通过了Ⅱ期临床试验[9]，具有较好的应用前景。

鉴于良好的临床应用前景，去水卫矛醇的新药开发和质量控制显得尤为重要。该品种原料[10]及制剂[11]的国家标准均采用滴定分析法测定含量，虽简便易行，但专属性较差。魏宁漪等[12]采用气相色谱(GC)法测定注射用去水卫矛醇的含量，但笔者在重现实验时发现药物在气化过程中存在降解的风险。吴先富等[13]采用磁共振法测定去水卫矛醇原料含量，但该法对仪器要求较高，应用受到较大限制。高效液相色谱法(HPLC)具有分析速度快、灵敏度高、专属性强的优点，是目前药品质量控制中最常用的方法之一。去水卫矛醇的化学结构式中缺乏生色团，无法采用紫外检测器测定其有关物质和含量，因此考虑采用柱前衍生化的方法改善其紫外吸收特性。二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDTC)是一种便宜易得的衍生化试剂，可与环氧基反应生成稳定的具有紫外吸收的产物。笔者采用DDTC作为柱前衍生化试剂，选择使用广泛的紫外检测器，探索建立测定去水卫矛醇含量的衍生化反相HPLC法，并利用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS)对衍生物进行结构确认。

1 仪器与试药

1.1仪器 日本岛津高效液相色谱仪(含二元高压输液泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器及Labsolution工作站)；安捷伦6420 HPLC-MS/MS三重四级杆液质联用系统(含安捷伦1260 Infinity高效液相色谱仪、自动进样器、电喷雾离子化接口、四级杆质谱检测器、MassHunter数据分析处理软件)；BT25-S型电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司，感量：0.01 mg)；XW-80A旋涡混合器(上海医大仪器有限公司)；HH-W三用恒温水箱(常州市国立试验设备研究所)；Mini-14K微型高速离心机(杭州奥盛仪器有限公司)；ZLS-1真空离心浓缩仪(湖南赫西仪器装备有限公司)。

1.2试剂 去水卫矛醇原料(批号170601)和对照品由广西梧州制药(集团)股份有限公司提供。乙腈(色谱纯，美国天地公司)；DDTC(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；实验用水为去离子纯化水；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Welch Ultimate XB-CN(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(50：50)，流速为1.0 mLmin-1，柱温为30 ℃，检测波长为278 nm，进样量为20 μL。

2.2质谱条件 电喷雾离子源，正离子检测模式，离子扫描范围m/z100～500，干燥气温度350 ℃，干燥气流速9 Lmin-1，雾化气压力103.425 kPa，喷雾电压4500 V。二级质谱采用产物离子扫描模式，裂解电压110 V，碰撞能20 eV。

2.3溶液的制备

2.3.1供试品溶液和对照品溶液 取去水卫矛醇原料和对照品10 mg，精密称定，分别置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液和对照品溶液。

2.3.2衍生化试剂溶液 精密称取DDTC适量，加水溶解并定量稀释制得浓度为5 %的衍生化试剂溶液。

2.3.3磷酸盐缓冲液(pH 值7.0) 取三水合磷酸氢二钾约0.439 g及磷酸二氢钾0.419 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。

2.4衍生化方法 精密量取去水卫矛醇对照品溶液和供试品溶液各400 μL，依次精密加入磷酸盐缓冲液(pH值7.0)400 μL和衍生化试剂溶液200 μL，涡旋30 s，40 ℃水浴反应30 min后，冰水浴5 min终止反应。精密加入乙酸乙酯2 mL，涡旋3 min萃取衍生物，离心5 min，精密量取上清液1.8 mL，用氮气吹干后，精密加入流动相800 μL复溶，进行HPLC分析。

2.5色谱方法的建立

2.5.1色谱柱的选择 笔者在本实验比较了Hypersil-CN(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Ultimate XB-CN(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Hedera ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)等不同品牌及填料的色谱柱对分析的影响，发现在Welch Ultimate XB-CN色谱柱上，分析物峰形对称且保留时间合适。

2.5.2检测波长的选择 精密量取去水卫矛醇对照品溶液适量，按“2.4”项处理后，用流动相溶解并稀释制成适宜浓度的溶液，于200～350 nm波长范围内扫描紫外吸收光谱图(图1)。结果表明，去水卫矛醇衍生物在278 nm处有最大吸收。

图1 去水卫矛醇衍生物的紫外吸收光谱

Fig.1Ultravioletabsorptionspectrumofdianhydroga-lactitolderivative

2.5.3流动相的选择 实验考察了甲醇-水和乙腈-水系统，发现采用乙腈-水系统作为流动相时，基线稳定且峰形尖锐，经系统摸索，最终确定流动相为乙腈-水(50：50，V/V)。

2.6去水卫矛醇衍生物的鉴定 取去水卫矛醇对照品溶液，按“2.4”项处理后，进行LC-ESI-MS/MS分析，特征碎片离子以及质谱裂解规律见图2。结果表明，[M+H]+准分子离子峰为445.1，与衍生物中含偶数氮的情况相符，特征碎片离子包括m/z116.1和427.2，因此鉴定该色谱峰对应的成分为去水卫矛醇衍生物。去水卫矛醇与DDTC的反应示意图见图3。

图2 去水卫矛醇衍生物的特征碎片离子谱

Fig.2Ionmassspectraofdistinctiveproductdianhydrogalactitolderivative

图3 去水卫矛醇与DDTC的化学衍生化反应示意图

Fig.3ReactionpathwayofderivatizationofdianhydrogalactitolandDDTC

2.7方法学考察

2.7.1专属性实验 空白干扰实验：分别取空白溶剂、去水卫矛醇对照品溶液和供试品溶液，按“2.4”项操作后，进行HPLC分析，典型的色谱图见图4。结果表明，在本色谱条件下，去水卫矛醇衍生物峰形良好，保留时间约为5.7 min，空白溶剂对主峰的测定无干扰。

A.空白溶液；B.对照品溶液；C.供试品溶液；1.衍生物

图4 衍生化去水卫矛醇的典型高效液相色谱图

A.blank solution；B.reference solution；C.sample solution；1.derivative

Fig.4RepresentativeHPLCchromatogramsofdianhydrogalactitolderivative

强制降解研究：取去水卫矛醇10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，分别进行酸破坏(0.1 mol·L-1盐酸溶液1 mL，室温2 h)、碱破坏(0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，室温2 h)、氧化破坏(3%过氧化氢溶液1 mL，室温1 h)、高温破坏(60 ℃ 2 h)和光照破坏(紫外灯下2 h)，用水稀释至刻度，摇匀，按“2.4”项处理后，进行HPLC分析，典型色谱图见图5。去水卫矛醇在酸和氧化条件下有明显降解，而在其他条件下较为稳定。本品进行制剂工艺改进、药效、药动学或毒理学研究时应注意药物的稳定性。

2.7.2检测限及定量限 精密称取对照品适量，用水溶解并定量稀释制成不同浓度的溶液，衍生化处理后进行HPLC分析，去水卫矛醇检测限(S/N=3)和定量

A.酸破坏 ；B.碱破坏 ；C.氧化破坏；D.高温破坏；E.光照破坏；F.未破坏；1.衍生物

A.acid degradation；B.alkaline degradation；C.oxidation degradation；D.heat degradation；E.light degradation；F.sample without destruction；1.derivative

Fig.5ReprehensiveHPLCchromatogramsofforceddegradationstudyondianhydrogalactitol

限(S/N=10)分别为30和100 ng·mL-1(n=5)。

2.7.3线性关系考察 精密称取对照品适量，加水溶解并定量稀释制成浓度分别为0.100，0.500，1.00，2.00，5.00，10.0及20.0 μgmL-1的系列标准溶液，按“2.4”项处理后，进行HPLC分析，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归。结果表明，去水卫矛醇在0.100～20.0 μg·mL-1范围内线性良好，典型回归方程为A=38 725C+755.19(r=0.999 8)。

2.7.4加样回收率 精密称取已测定含量的去水卫矛醇原料约10 mg，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置20 mL量瓶中，分别精密加入质量浓度为100 μg·mL-1的去水卫矛醇对照品溶液0.6，1.0，1.4 mL，用水稀释至刻度，摇匀，作为浓度水平80%，100%和120%的回收率溶液，每个浓度水平配制3份。按“2.4”项处理后，进行HPLC分析。结果见表1，加样回收率为98.2%～101.3%，方法准确度良好。

2.7.5精密度实验 供试品溶液经衍生化反应后，按上述色谱条件连续进样6次，峰面积的RSD为1.15%，表明进样精密度良好。

2.7.6重复性实验 配制6份供试品溶液，按“2.4”项处理后，进行HPLC分析。结果表明，6份样品含量RSD为1.44%，重复性良好。

2.7.7稳定性实验 将供试品溶液按“2.4”项处理后，分别于0，2，4，6，10 h进行HPLC分析，与0h比较，不同时间峰面积在0 h峰面积的99.5%～100.8%范围内，去水卫矛醇衍生物在10 h内稳定性良好。另将供试品溶液在室温下放置不同时间后，进行衍生化HPLC分析，不同时间测定的含量在98%～102%，表明去水卫矛醇水溶液在室温至少可放置4 h。

表1 去水卫矛醇加样回收率结果

2.8含量测定 取对照品溶液及供试品溶液，按“2.4”项处理后，进行HPLC分析，典型色谱图见图4。按外标法计算，样品的平均含量为100.5%。

3 讨论

去水卫矛醇具有环氧环的特征结构，可与DDTC发生衍生化反应，生成具有紫外吸收的衍生物，用广泛使用的紫外检测器检测。笔者考察不同温度(25，40，60 ℃)、加热时间(5，15，30，45，60，90和120 min)、衍生化试剂浓度(1%，2%，3%，5%和10%)以及不同反应体系pH值(6.0，7.0和8.0)，发现药物与5% DDTC在pH 值7.0条件下，于40 ℃水浴加热30 min可衍生化完全。为了除去过量的衍生化试剂，避免其干扰衍生物的测定，实验比较了乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚等试剂的萃取效率，发现乙醚和乙酸乙酯的效果最好，考虑到操作的简便性和安全性，最终选择乙酸乙酯作为萃取剂。

笔者建立了衍生化HPLC法测定去水卫矛醇含量，该方法线性范围宽，重复性好，稳定性高，简单易行，易于在普通实验室操作，不仅可用于去水卫矛醇原料的质量控制，还可用于去水卫矛醇制剂和生物样品的分析，对去水卫矛醇的新药开发、生产和临床应用具有重要的参考价值。