壳聚糖山苓祛斑凝胶的高效液相指纹图谱*

陈军，熊鑫，余南才

(武汉市第一医院药学部，武汉 430022)

壳聚糖山苓祛斑凝胶是由茯苓、白芷、白术、白芨、当归、丁香等12味药材组成，临床上主要用于治疗黄褐斑，为我院中医部周利副主任医师经验方，具有活血行气、祛斑养颜的功效，本方临床使用多年，用于治疗黄褐斑，疗效确切。本方涉及多味中药，化学成分较复杂，且还受各味药材的产地、用药部位和制备工艺的影响，仅以尿囊素、羟基红花黄色素A的含量测定作为质量控制的方法，难以全面准确地反映该制剂的质量。而指纹图谱能在一定程度上反映其质量的可控性、稳定性及真实性。质量控制方式及技术体系[1-7]能全面地反映制剂的内在特征。本实验采用高效液相色谱(HPLC)法建立壳聚糖山苓祛斑凝胶的指纹图谱检测方法，为提高壳聚糖山苓祛斑凝胶的质量控制标准和全面的质量检查提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(紫外检测器，四元泵，柱温箱)，BP211D电子天平(德国赛多利斯公司，Max210g ，d=0.01mg)。

1.2试药 欧前胡素(批号：110826-201616)、异欧前胡素(批号：110827-201611)、阿魏酸(批号：110773-201614)、丁香酚(批号：110725-201615)均购自中国食品药品检定研究院；壳聚糖山苓祛斑凝胶自制，批号分别为：20170510，20170512，20170520，20170525，20170527，20170601，20170603，20170605，20170610，20170613，甲醇为色谱纯(美国TEDIA公司)，二氯甲烷、磷酸为分析纯(天津市白世化工有限公司)，纯化水自制。

2 方法与结果

2.1色谱条件 AgilentC18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流动相为甲醇(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～10 min，25%A；>10～28 min，25%A→55%A；>28～45 min，55%A→85%A；>45～50 min，85%A→25%A)[8-14]，检测波长286 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液制备 分别精密称取减压干燥至恒重的欧前胡素、异欧前胡素、阿魏酸、丁香酚对照品适量至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再分别精密移取上述对照品适量至同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液(欧前胡素123.5 μg·mL-1、异欧前胡素108.4 μg·mL-1、阿魏酸122.9 μg·mL-1、丁香酚96.6 μg·mL-1)。

2.2.2试品溶液制备 精密称取本品(批号：20170510)5 g至烧杯中，加入纯化水15 mL溶解后转移至分液漏斗中，加二氯甲烷萃取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷，水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容于25 mL量瓶中，经孔径0.45 μm 微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，备用[15-17]。

2.3方法学考察

2.3.1精密度实验 取壳聚糖山苓祛斑凝胶(批号：20170510)，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续自动进样6次进行测定，记录色谱图，以阿魏酸为参照峰，测得样品各共有峰相对保留时间RSD<1.0%，相对峰面积RSD<3.0%，说明该仪器的精密度良好。

2.3.2稳定性实验 取壳聚糖山苓祛斑凝胶(批号：20170510)，按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，分别于0，3，5，10，15，20 h自动进样，记录色谱图，以阿魏酸为参照峰，测得样品各共有峰相对保留时间RSD<2.0%，相对峰面积RSD<5.0%，表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。

2.3.3重复性实验 取同一批号(20170510)壳聚糖山苓祛斑凝胶，按“2.2.2”项方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录色谱图，以阿魏酸为参照峰，测得样品各共有峰相对保留时间RSD<3.0%，相对峰面积RSD<5.0%，表明该方法的重复性良好。

2.4指纹图谱的建立及分析

2.4.1指纹图谱的建立 取10批壳聚糖山苓祛斑凝胶的供试品，分别按“2.2.2”项方法制备供试品溶液10份，按“2.1”项色谱条件测定，记录色谱图，将10批壳聚糖山苓祛斑凝胶的液相色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2010版)软件进行评价，建立壳聚糖山苓祛斑凝胶的指纹图谱[18-19]，并生成对照色图谱R(图1)。

图1 10批壳聚糖山苓祛斑凝胶HPLC指纹图谱及对照图谱

Fig.1HPLCfingerprintandreferencefingerprintoftenbatchesofchitosanShanlingQubangel

2.4.2共有峰的标定及参照峰的选择 对供试品溶液的色谱图进行分析，标定了壳聚糖山苓祛斑凝胶中出峰时间稳定、特征明显的10个共有峰为特征峰(图2)，并确定了其中2，5，7，9号峰分别为欧前胡素、阿魏酸、异欧前胡素、丁香酚(图3)。其中5号峰阿魏酸的保留时间居中，分离度好，峰面积大，易于辨认，故选为本品指纹图谱的参照峰。

图2 共有峰色谱图

Fig.2Commonpeaksofthechromatogram

2.欧前胡素；5.阿魏酸；7.异欧前胡素；9.丁香酚

2.4.3指纹图谱相似度评价 对10批壳聚糖山苓祛斑凝胶所测得的色谱图采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2010版)软件进行分析，进过数据匹配，以中位法建立指纹图谱，得10批样品和对照指纹图谱的相似度均>0.9(表1)。并以5号峰阿魏酸为参照物，计算各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，见表2，3。

3 讨论

3.1波长的选择 本制剂中所含的大部分药材在2015版《中华人民共和国药典》及其他文献均无或极少HPLC检测方法，故选取白芷、当归、柴胡、丁香、红花等有HPLC法的几味药材来选定检测波长，其中，柴胡和红花的检测波长分别为210和403 nm，紫外光吸收少，壳聚糖山苓祛斑凝胶样品的整体峰吸收较差，不利于制剂指纹图谱的采集，故参考文献，选取白芷中欧前胡素、异欧前胡素、当归中阿魏酸、丁香中丁香酚结合全波长扫描来选取检测波长，其中286 nm处色谱峰信息丰富，基线平稳，特征峰明显，故选取286 nm作为壳聚糖山苓祛斑凝胶指纹图谱的检测波长。

3.2流动相的选择 本制剂考察了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸等常用的指纹图谱流动相系统，其中在甲醇-磷酸条件下，色谱峰峰型良好，特征峰多，并结合梯度洗脱，色谱峰分离度好，故选择甲醇-磷酸作为壳聚糖山苓祛斑凝胶指纹图谱的检测流动相。

本实验对10批壳聚糖山苓祛斑凝胶的指纹图谱进行相似度计算，10批壳聚糖山苓祛斑凝胶的相似度、相对保留时间和相对峰面积均在合理的范围内，表明壳聚糖山苓祛斑凝胶各批次成分间性质稳定，说明该制剂的制备工艺纯熟，本实验建立的壳聚糖山苓祛斑凝胶指纹图谱方法简单，易操作，可用于完善其质量标准的研究。

表1 10批壳聚糖山苓祛斑凝胶指纹图谱相似度结果

表2 10批壳聚糖山苓祛斑凝胶共有峰的相对保留时间

表3 10批壳聚糖山苓祛斑凝胶共有峰的相对峰面积