直肠癌病理组织中TIPE3表达与淋巴结转移、复发及生存率的关系

祝云霄,冯美燕,冯占军

肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8(tumor necrosis factor-α-induced protein 8, TNFAIP8或TIPE)家族在维持免疫平衡、调控肿瘤生长中发挥重要作用[1]。该家族成员包括TIPE、TIPE1、TIPE2、TIPE3，结构具有高度同源性。TIPE基因多态性与非霍奇金淋巴瘤易感性密切相关[2]，且TIPE对胃癌有促癌作用[3]；TIPE1对调节细胞凋亡有重要作用[4]，且对肝癌及肺癌有抑癌作用[5-6]；TIPE2是重要的免疫负调控分子[7]，近年研究显示其在肿瘤发生发展中也有重要作用[8]。但针对TIPE3特性及功能的报道较少，目前尚不明确其在直肠癌发生及发展中是否发挥作用，基于此，本研究拟重点观察直肠癌病理组织中TIPE3的表达，并分析其与患者临床病理特征及预后的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年1月至2014年1月于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院手术切除且病理证实为直肠腺癌的75例肿瘤标本及相应的癌旁正常组织。患者中男36例、女39例；年龄38～79岁，平均(59.27±9.24)岁；Dukes分期A期13例、B期11例、C期22例、D期29例；分化程度高分化19例、中分化38例、低分化18例。入组患者均对本研究知情，且签署同意书，本研究已获得医院伦理委员会批准。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：①接受直肠癌前切除术(Dixon)或腹会阴联合直肠癌根治术(Miles)治疗；②术后病理组织确诊为直肠癌；③术前未接受放化疗；④对本研究知情，签署同意书。排除标准：①合并其它恶性肿瘤；②临床病理资料缺失及随访依从性不高者。

1.3 方法

1.3.1 主要试剂

辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG，购自北京中山金桥；HRP-DAB底物显色试剂盒，购自北京天根；苏木素，购自福州迈新；兔抗人TIPE3多克隆抗体，委托武汉博士德生产。

1.3.2 检测方案

所有肿瘤及癌旁正常组织标本均采用免疫组织化学法检测TIPE3表达情况：①标本切片至于60 ℃烤箱1 h，常规脱蜡至水后抗原修复，山羊血清封闭，室温孵育15 min；②加入1∶200稀释的一抗(兔抗人TIPE3多克隆抗体)，4 ℃孵育过夜；③加入1∶1 000稀释的二抗(辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG)，37 ℃孵育15 min；④加入HRP标记链亲和素，37 ℃孵育15 min；⑤DAB显色，苏木素复染，封片，镜下观察。

1.3.3 评分标准

以着色强度及阳性着色细胞占比综合评分[10]：①着色强度评分：不着色，与背景一致，记0分；淡黄色，略高于背景，记1分，黄色，明显高于背景，记2分；棕褐色，记3分；1～3分均表示阳性着色；②阳性着色细胞占比评分：阳性着色细胞占比为0，记0分；占比<10%，记1分；占比10%～49%，记2分；占比50%～74%，记3分；占比>74%，记4分；③样本总分=着色强度评分×阳性着色细胞占比评分，总分>3分为阳性。

1.4 观察指标

①患者临床病理指标，包括性别、年龄、肿瘤分化程度，病理T分期、N分期、M分期、Dukes分期、肿瘤大小等。②患者预后，采用电话、门诊复查等结合方案，对患者进行持续随访，统计复发及死亡情况，截至2018年8月1日，以手术结束日为复发及生存时间统计起点。

1.5 统计学方法

采用SPSS 25.0处理数据，计数资料计算构成比，差异性对比采用卡方检验，关联性对比采用McNemar法和Kappa一致性分析；生存分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织及癌旁正常组织TIPE3表达情况

肿瘤组织中TIPE3阳性57例，占76.00%，癌旁正常组织中TIPE3阳性51例，占68.00%。肿瘤组织和癌旁正常组织TIPE3表达情况具有高度一致性(к=0.803；P<0.001)，诊断结果的差异有统计学意义(P=0.031)，6例患者TIPE3表达不一致，表现为癌旁正常组织低表达而肿瘤组织高表达，见表1。图1所示，为某肿瘤组织TIPE3阳性表达、癌旁正常组织TIPE3阴性表达患者相关组织的染色结果示例。

表1 肿瘤组织及癌旁正常组织TIPE3表达情况[n(%)]

注：McNemar检验，P=0.031；Kappa一致性检验，к=0.803,P<0.001

①癌旁正常组织TIPE3阴性表达；②肿瘤组织TIPE3阳性表达

2.2 TIPE3表达与直肠癌临床病例特征的关系

TIPE3阳性表达患者中，T3～4期、N1～2期、M1期、Dukes分期C～D期者占比均分别明显高于TIPE3阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 TIPE3表达与结肠癌临床病例特征的关系[n(%)]

2.3 TIPE3表达情况与患者累积无复发生存时间的关系

图2 TIPE3阳性患者与阴性患者累积无复发生存时间对比

2.4 TIPE3表达情况与患者累积生存时间的关系

图3 TIPE3阳性患者与阴性患者累积生存时间对比

3 讨论

直肠癌是常见恶性肿瘤，早期确诊率低，患者确诊时多已进入中晚期，预后较差[11]。该疾病的发生及发展是一个复杂的过程，目前研究显示多种基因表达异常在其病程发展过程中发挥重要作用[12]，探索与直肠癌发生、进展及预后紧密相关的分子蛋白，对疾病的早期诊断、后期治疗选择等有重要意义。

TIPE家族是由肿瘤坏死因子-α诱导产生的蛋白之一，家族成员均含有与死亡结构域相关的高度同源序列，具有高度保守的TH结构域，与体内免疫及肿瘤发生及发展密切相关[13]。研究证实，TIPE3是磷脂酰肌醇通路中的第二信使转移蛋白，在食管癌及肺癌组织中有促癌作用[14]，国内报道进一步证实抑制结肠癌中TIPE3表达，对SW480结肠癌细胞有促进凋亡、抑制增殖的作用[15]。但仍不明确TIPE3在直肠癌病理组织中的表达情况及其与患者临床病理特征及预后的关系。

本研究显示，直肠癌病理组织与正常组织中TIPE3均呈明显高表达，两者TIPE3表达情况呈高度一致性，75例患者中，仅有6例肿瘤组织及癌旁正常组织中TIPE3表达不一致，CUI等[16]观察到结肠单层柱状上皮及肠腺细胞中TIPE3呈阳性表达状态，上述结论提示TIPE3在正常结肠细胞中即有较高表达水平，其可能与直肠癌的发生无明显关系。但在乳腺癌、肝细胞肝癌、食管癌核非小细胞肺癌等肿瘤组织中，TIPE3的表达要高于癌旁组织[17]。这说明TIPE3不是肿瘤组织所特有的一种蛋白，其可能在分泌、增殖等功能比较旺盛的细胞中大量表达，肠上皮细胞分泌及增殖功能也较强，这可能是直肠癌及癌旁组织TIPE3表达均较高的原因。因此，难以通过检测TIPE3表达情况预测直肠癌风险。

但本研究显示在直肠癌组织中TIPE3阳性表达可能与肿瘤的浸润、淋巴结及远处转移密切相关：TIPE3阳性表达者，T、N、M高分期者均明显高于TIPE3阴性表达者。这主要是因为TIPE3的TH结构域疏水腔能与脂质分子的酰基结合，故其能够作为一个脂质转运蛋白，促进蛋白激酶B、磷酸肌醇依赖性蛋白激酶磷酸化，从而激活磷脂酰肌醇信号通路，促进肿瘤细胞增殖[18]。但研究[14]显示，TIPE3中的TH结构域的作用与其它TIPE家族成员并不完全一致，其作用还与TIPE3独有的N端结构域有关，过表达的去除N端的TIPE3可促进肿瘤细胞的死亡。这提示对已发生直肠癌的患者，使N端缺失的TIPE3过表达，可能有助于抑制肿瘤的发展，但仍有待后续研究证实。

本研究显示TIPE3阴性表达者预后明显好于TIPE3阳性表达者，提示TIPE3对患者预后有明显影响，这可能也与其对肿瘤浸润及转移的影响有关：已证实TNM高分期直肠癌患者的预后较差[19-20]，而TIPE3阳性表达者TNM分期往往较高。可见，靶向干预TIPE3表达，对提升直肠癌预后可能有一定作用，但仍需临床研究证实。

综上，直肠癌病理组织及癌旁正常组织中TIPE3表达情况呈较高的一致性。结肠癌组织中TIPE3阳性表达者淋巴结转移、复发及死亡风险更高。积极检测TIPE3表达情况，对临床制定个体化治疗方案可能有一定价值。