白细胞介素9在重症肌无力发病中的作用

何柳平，杨欢

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）是一种由于神经肌肉接头突触后膜乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AchR）被自身抗体破坏，从而引发神经肌肉接头传递障碍的自身免疫性疾病，其主要症状是骨骼肌易疲劳性[1]。研究显示，AChR-特异性的辅助性T（Th）细胞与自身反应性抗体的产生密切有关，并在MG和实验性自身反应性重症肌无力（experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）中起着重要作用[2]。CD4+T细胞可分为Th1、Th2、Th17及调节性T细胞等[3,4]，在MG的发生、发展中均发挥着重要作用。既往认为IL-9是Th2相关的细胞因子，现已表明IL-9主要是由CD4+Th细胞亚群中的Th9所分泌[5]，在炎症性疾病中有着重要作用[6-8]。研究显示，血清IL-9水平在EAMG中上升，IL-9抗体能抑制EAMG动物疾病进展和降低血清中抗AChR Ab IgG的水平[9]。但针对IL-9在MG患者中的研究极少，本研究通过检测MG患者治疗前后血清及CD4+T细胞中IL-9的水平，进一步分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年3月至2018年4月就诊于中南大学湘雅医院神经内科确诊为MG的患者22例纳入MG组，14例患者有抗胆碱酯酶剂服用史，均无免疫抑制剂服用史。MG诊断标准：具备MG典型的临床症状和体征，即疲劳试验阳性，同时新斯的明试验阳性，并经神经电生理检查确诊。记录患者年龄、性别、用药史、定量重症肌无力评分（quantitive myasthenia gravis score，QMG）及抗AChR抗体滴度。选择我院排除感染、神经系统及自身免疫系统疾病、且性别和年龄匹配的健康体检者21例纳入对照组。2组年龄和性别差异无统计学意义，见表1。本研究获得医院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

表1 2组一般情况比较

1.2 方法

1.2.1 主要试剂与材料 人血清IL-9检测试剂盒购于美国ThermoFisher公司，人外周血CD4+T分选磁珠购于德国Miltenyi公司，逆转录及荧光定量PCR试剂盒购于加拿大Abm公司。

1.2.2 血清标本收集及指标检测 MG组患者给予免疫抑制剂治疗（其中口服糖皮质激素15例，口服他克莫司3例）治疗，共治疗8周。于治疗前、后，抽取患者静脉血10 mL，分离血清，－80℃保存。对照组于体检时抽取患者静脉血10 mL，分离血清，－80℃保存。①血清IL-9水平检测：采用ELISA法检测血清IL-9水平，试验步骤及结果定性严格参照ELISA试剂盒说明书。②CD4+T细胞IL-9表达水平检测：2组各随机选取8例受试，密度离心法提取人外周血中单个核细胞，免疫磁珠分选单个核细胞中的CD4+T细胞，流式检测分选细胞纯度＞95%。Trizol法提取CD4+T细胞总mRNA，采用RT-qPCR法检测IL-9表达。所有实验步骤均按照说明书操作。③抗AChR抗体滴度检测：送血清样本至广州达安检验公司，采用ELISA法检测抗AChR抗体滴度。④于治疗前、后对患者进行进行QMG评分[10]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 23.0及Graph Prism5.0软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本均数t检验；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本研究结束时，MG组失访4例，共获得18例数据，纳入分析。MG组治疗前血清IL-9水平为（9.12±1.13）pg/mL，高于对照组的（4.51±0.96）pg/mL（P＜0.05）；MG组治疗后血清IL-9水平为（3.13±0.42）pg/mL，低于本组治疗前（P＜0.05）；见图1。

RT-qPCR法检测结果显示，治疗前MG组外周血CD4+T细胞中IL-9的相对表达水平高于对照组（P＜0.05）；治疗后MG组CD4+T细胞中IL-9的相对表达水平为低于本组治疗前（P＜0.05）；见图2。

将MG患者治疗前、后血清IL-9水平分别与对应时间点的QMG评分和抗AChR抗体滴度进行相关性分析，未发现IL-9水平与QMG评分，IL-9水平与抗AChR抗体滴度之间存在显著相关性，见图3。

图1 各组血清IL-9水平及治疗前后变化

图2 各组CD4+T细胞中IL-9的表达水平及治疗前后变化

图3 血清IL-9水平与QMG评分和抗AChR抗体滴度的相关性

3 讨论

既往研究显示，CD4+T细胞及其辅助细胞亚群中的Th1、Th2及Th17、调节性T细胞（Treg）均参与了MG和EAMG的发生[2,11]。当CD4+初始T细胞受到转化生长因子β（TGF-β）和IL-4的共同刺激后，可分化为Th9[12]。Th9在Ⅱ型变态反应方面的功能与Th2细胞有关，而在自身免疫方面与Th1细胞和Th17细胞有关，其分泌的IL-9可在Th1/Th17细胞介导的炎症和Treg中产生广泛作用[13,14]。MG是一种自身免疫性疾病，探讨IL-9在MG患者中的表达与作用有助于阐释MG的发病机制。本研究结果显示，与对照组相比，MG组治疗前血清IL-9水平明显升高，MG组治疗后血清IL-9水平较治疗前下降（均P＜0.05）。这与EAMG动物实验结果显示的Th9比例及血清IL-9水平上升相一致[9]。在其他自身免疫相关性疾病也有类似报道，IL-9细胞比例及血清IL-9在类风湿性关节炎[15]、系统性红斑狼疮[16,17]中升高。IL-9在MG发病机制中所起作用，可能是由于Th9细胞能通过分泌IL-9介导募集自身免疫功能的Th17细胞[18]，而Th17细胞和调节性T细胞失衡在MG发病机制中的作用已被报道[2,19]。进一步研究显示Th17细胞也可产生大量IL-9[20]，而产生的IL-9反过来可使Th17扩增，从而在类风湿关节炎[21]、多发性硬化[22]和系统性红斑狼疮[23]等自身免疫疾病中起作用。在IL-9R敲除的EAE小鼠模型中，Th17数量减少[24]。与此一致，在MG外周血中Th17比例增加[19]，由此推测IL-9可能通过影响CD4+T的不同亚群细胞，在MG中起作用，这需要进一步的研究去验证。

Th9细胞主要由CD4+初始T细胞分化而来，而IL-9主要由Th9分泌[18]。因此，本研究进一步分析MG患者CD4+T细胞中IL-9的水平，结果显示与对照组相比，MG组治疗前CD4+T细胞中IL-9表达上调，且MG组治疗后其IL-9水平较治疗前下降（均P＜0.05）。Ouyang等[25]研究发现在未接受治疗的系统性红斑狼疮患者中，血清IL-9水平升高，经过激素治疗，其水平出现下降。目前的研究尚未阐明免疫治疗使血清IL-9水平下调的机制。推测有以下几个原因：①免疫治疗使血清中IL-4下降[26]，从而引起由CD4+初始T细胞转化分泌IL-9的Th9细胞减少。②激素治疗可降低外周血中产生IL-9的CD4+T数量[25]。这提示IL-9在MG的发病过程中可能起了一定的作用，需进一步研究证实。

研究显示，IL-9能促进B细胞分泌IgE和IgG抗体[27-30]。本研究结果显示：IL-9与患者血清中抗AChR抗体滴度之间并无明显相关性，这与前人的研究不一致。既往研究显示，IL-9抗体能抑制EAMG动物疾病进展和降低血清中anti-AChR Ab IgG的水平[9]。在系统性红斑狼疮动物模型中，也发现IL-9抗体能降低血清抗dsDNA抗体滴度，缓解狼疮肾炎的症状[31]。在系统性红斑狼疮中，IL-9和IL-17能通过激活B细胞内的JAK/STAT途径，增加STAT3磷酸化，进而诱导B细胞的活化与自身抗体的产生[32,33]。在EAMG中，应用IL-9抗体后也发现STAT3表达是下调的[9]，但是在MG患者中尚无此研究，故需要进一步扩大样本量去验证IL-9与MG血清中抗AChR抗体的关系，并提示最好的是验证AChR抗体特异性B细胞与IL-9之间的关系。本研究中未发现IL-9与患者QMG评分之间的明显相关性。血清IL-9水平与自身免疫性疾病的严重程度及治疗的关系尚存在争议，既往也有研究显示在系统性红斑狼疮及风湿性关节炎患者中，其血清IL-9与疾病的严重程度之间无明显相关性[16]。这可能与IL-9既能促进Th17扩增，又增强Treg细胞的抑制功能[19,34]有关。在不同疾病的复杂机体免疫反应过程中，Th9可作为一把“双刃剑”，既有免疫保护的作用，也有免疫致病的方面。

综上所述，本试验结果显示IL-9在成年人MG患者治疗前的血清和CD4+T细胞中表达升高，且治疗后下降，其可能参与了MG的发病过程。但是否可作为评价MG的治疗监测指标，还需进一步加大样本量，进行临床分析。