蝙蝠葛苏林碱通过拮抗缓激肽诱导的胞内钙升高发挥神经保护作用

郭华丽，李祖铭，余玲，丁杰，郭莲军

钙离子是细胞内信号传导的重要信使物质之一，神经细胞内钙离子浓度增高可使多种钙依赖性降解酶活性增强；如蛋白酶激活可引起细胞骨架受损，核酸内切酶激活可导致核酸分解。中枢神经系统多种疾病如痴呆、卒中等，均与神经细胞内钙离子的调节紊乱有关[1-4]。

蝙蝠葛苏林碱（daurisoline，DS）从防己科植物蝙蝠葛苏林的根茎中提取，属双苄基异喹啉类生物碱，对多种动物实验性心律失常具有拮抗作用[5,6]，并对谷氨酸引起的大鼠大脑皮质神经元损伤有保护作用[7]。目前尚无关于DS影响神经细胞内钙的研究。本研究采用原代培养的大鼠皮质神经细胞，用缓激肽（bradykinin，BK）处理建立胞内钙失衡，诱导神经细胞损伤模型，观察DS对胞内钙增加的作用，探究其对神经细胞的保护作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

SD乳鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证编号为SCXK(鄂)2014-0007。DS纯度＞98%，由华中科技大学同济医学院药理学系提供，用1 mmol/L盐酸溶解，再用2 mol/L NaOH调pH至6.8，配成母液4℃保存。BK、Fur-2/AM、Triton X-100、EGTA、HEPES、DMSO购于Sigma公司，DMEM/F12培养基、胎牛血清、牛血清白蛋白购于Gibco公司；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮质神经元原代培养[8]取1～3 d龄的SD乳鼠8～10只，消毒后断头取全脑，分离大脑皮质，人工脑脊液清洗后置于安剖瓶，加2 mL D-Hank’s液，剪成2×2×2 mm3块状物，放于刻度试管内加入0.25%胰酶（1:1），37℃孵育15～20 min后，用吸管吹打混匀，加入少许完全培养基终止消化，用200目筛网过滤后，加入基础培养基至10 mL，1 000 rpm离心10 min 2次；去上清，加入完全培养基，调整细胞密度为5.0×105/mL，分别种植于预先用0.1%多聚赖氨酸包被的96孔板或小盖玻片上，置CO2培养箱内（37℃，5%CO2）培养。培养至第5天，培养液中加阿糖胞苷（终浓度为5 μg/mL）抑制非神经细胞的生长。阿糖胞苷作用48 h后，更换新鲜的完全培养基继续培养，每2天半量换液。培养至第10天时，将细胞分别用于细胞内钙测定和细胞活性检测。

根据处理方式的不同，将细胞分为对照组，BK（1µmol/L）组，DS低（1×10-6mol/L DS+1µmol/L BK）、中（1×10-5mol/L DS+1 µmol/L BK）、高（1×10-4mol/L DS+1µmol/L BK）剂量组，各8个样本。对照组不做任何处理；BK组给予1µmol/L的BK处理；DS低、中、高剂量组分别给予相应浓度的DS预孵育3 min，然后给予1µmol/L的BK处理。

1.2.2 神经元[Ca2+] i测定 以Fura-2/AM为钙指示剂，用细胞内双波长荧光钙成像系统（TILL，德国）进行[Ca2+] i测定。细胞培养至第10天时，取出生长于盖玻片上的细胞，加入荧光探针Fura-2/AM（终浓度1 μmol/L），避光孵育45 min。孵育后的细胞洗涤3次，将贴有细胞的盖玻片放入细胞浴槽中，通过TILL测量系统分别用340 nm和380 nm波长的激发光激发细胞内的Fura-2，检测产生的荧光强度，R值（F340nm/F380nm）与[Ca2+] i正相关，以R值变化表示[Ca2+] i变化。采样频率为1 Hz。胞内钙的变化率计算：[Ca2+] i变化率/%=(胞内钙峰值－基础值)/基础值×100%；基础值为给药前的稳定值，胞内钙峰值为药物处理后的最大值。

DS低、中、高剂量组分别给予相应浓度的DS预孵育3 min后测量基础值。基础值测量完成50 s后，BK组及DS低、中、高剂量组均加入1µmol/L的BK。对照组不作处理。BK加入后立即观察胞内钙变化，记录峰值，计算[Ca2+] i变化率。

1.2.3 细胞形态学与细胞活性检测 将培养至第10天的细胞按以上分组处理，细胞加入BK后继续培养12 h，在显微镜下观察细胞形态学变化。

采用MTT法检测细胞活性。在培养细胞的96孔板中加入MTT（200 μL/孔），37 ℃孵育4 h，去上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜，气浴震荡10 min，全自动酶标仪测定各孔在570 nm处的OD值。细胞存活率/%=(实验组OD570－空白对照组OD570)/(正常对照组OD570－空白对照组OD570)×100%。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 DS对BK诱导胞内钙离子浓度升高的影响

加入BK后，培养的细胞胞内钙离子浓度迅速升高，于15～20 s达峰值，随后又逐渐回复至初始水平。DS预处理对BK引起的细胞内钙离子浓度升高有明显的抑制作用，且抑制作用呈浓度依赖性，见表1。

表1 DS对BK诱导的胞内钙离子浓度升高的影响（%,±s）

表1 DS对BK诱导的胞内钙离子浓度升高的影响（%,±s）

注：与BK组比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组别对照组BK组DS低剂量组DS中剂量组DS高剂量组例数8 8 8 8 8细胞内[Ca2+] i变化百分率----302.19±47.25 252.74±51.10①215.11±51.28①152.36±37.80②

2.2 DS对BK诱导胞内钙离子升高所致神经损伤的影响

实验结果显示，BK可诱导培养的大鼠皮质细胞受损。BK处理12 h后，神经元数量明显减少，细胞膜不完整、胞体膨胀甚至破裂、细胞核固缩、折光性差；DS各剂量处理组细胞数量明显增加，见图1。MTT结果显示，对照组神经元存活率为100.00%，BK组为（50.61±5.48）%，明显低于对照组（P＜0.05）；DS低、中、高剂量组的存活率分别为（67.53±8.41）%、（71.50±7.54）%和（89.08±3.23）%，均高于BK组（P＜0.05），见图2。

图1 各组经BK处理后的细胞形态

图2 各组细胞存活率柱状图

3 讨论

BK是CaMII特异性激动剂，可与细胞膜上的B2受体结合，通过G蛋白介导激活磷脂酶C，经肌醇磷脂代谢途径，使IP3二酰甘油增加，促使内钙释放和继发性外钙内流，从而导致胞内钙离子浓度升高[9,10]。细胞内钙离子超载，可激活钙依赖性的钙调蛋白，改变细胞的结构和功能，导致细胞损伤。本研究用BK诱导建立胞内钙失衡的细胞模型，采用DS预处理拮抗BK诱导的神经细胞胞内钙离子浓度升高，探讨DS对神经细胞内钙稳态失调的拮抗作用及细胞保护作用。结果显示，DS可浓度依赖性的抑制BK引起的胞内钙离子浓度升高，对BK引起的细胞损伤具有一定的保护作用。但本研究样本量偏少，后续将增加样本量，进一步对其机制进行深入研究。