HPLC法测定棘豆止咳散中甘草苷的含量

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1.内蒙古蒙医药工程技术研究院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学蒙医药学院， 内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古自治区库伦旗蒙医医院，内蒙古 库伦旗 028000

棘豆止咳散为内蒙古通辽市库伦旗蒙医医院的医院制剂，由甘草、川贝母、多叶棘豆、石膏4味药组成。其中，叶棘豆为君药、川贝母为臣药、甘草为使药、石膏为佐药，该药对于多种咳嗽均具有明显疗效，老人和儿童均可使用[1]。甘草作为其中一味重要组成药味，为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.胀果甘草GlycyrrhizainflataBat.或光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根茎[2]。甘草自古以来就作为镇咳药广泛应用[3-4]。甘草中含有皂苷和黄酮两大类成分[5-6]，已有研究表明黄酮类成分具有显著的镇咳作用[7-8]。本实验采用HPLC法对棘豆止咳散中药效成分甘草苷的含量进行了测定，并进行了方法学考察。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AT 手动高效液相色谱仪(岛津)；BS224 S分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；FW-177高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；HW-526数显恒温水浴锅(上海恒科学仪器有限公司)。

1.2 材料 95%乙醇(天津市永大化学有限公司)；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。多叶棘豆(批号：1807046)、甘草(批号：170628)、川贝母(批号：1701036)、生石膏(批号：1703067)等药材均由赤峰荣兴堂药业有限责任公司蒙中药饮片厂提供；甘草苷对照品(批号：111610-201607，中国食品药品检定研究院)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：X Terra MSC18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流动性：A相为乙腈，B相为0.05%磷酸水，按表1规定进行梯度洗脱；检测波长：237 nm；柱温：40℃；流速：1.0 mL/min；检测时间：40 min；进样量：10 μL。在上述条件下，供试品溶液中甘草苷的吸收峰与其他相关峰均能达到较好分离，分离度大于1.5，理论塔板数以甘草苷计不低于2000。按棘豆止咳散处方制备工艺自制不含甘草药材的阴性供试品溶液，按上述色谱条件进样，结果阴性供试品溶液对样品测定无干扰。色谱图如图1所示。

表1 流动性梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取甘草苷对照品，精密称定，加70%乙醇制成每1 mL含甘草苷0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取由甘草、川贝母、多叶棘豆、石膏(2∶1∶2∶1)比例制备的散剂粉末(过100目筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇30 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察 精密称量甘草苷对照品1.08 mg定容于10 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液使其溶解，并稀释至刻度，得其甘草苷浓度为0.108 mg/mL。分别精密吸取5、7.5、10、12.5、15 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见下表2，以对照品吸收峰面积为纵坐标Y，进样量(μL)为横坐标X，绘制标准曲线,如图2所示。

表2 甘草苷线性关系考察

其中R2=0.9993，说明甘草苷在该范围内有良好的线性关系。

2.4 精密度试验 精密吸取“2.3”项下对照品溶液，同一天内连续进样6针，精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见下表，根据其峰面积计算其RSD值为0.502%，表明该仪器精密度良好，见表3。

表3 精密度实验试验结果

2.5 重复性试验 精密称量取同一批棘豆止咳散散剂粉末6份，分别按照“2.2.2”供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定，同一天内连续进样6针，精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪测定，结果见下表，根据其峰面积计算其RSD值为0.632%，表明方法重复性良好。见表4。

表4 重复性试验结果

2.6 稳定性试验 按“2.1”项下色谱条件进行测定，精密称取同一批棘豆止咳散散剂粉末一份，按照“2.2.2”供试品溶液制备方法制备，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪测定，结果见表5，根据其峰面积计算其RSD值为2.849%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

表5 稳定性试验结果

2.7 回收率试验 精密称量甘草苷对照品10.06 mg定容于10 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液使其溶解，并稀释至刻度，得其甘草苷浓度为1.006 mg/mL。精密称取同一批棘豆止咳散散剂粉末9份，每份0.25 g左右，在其中加入甘草苷对照品0.5 mL、1 mL、1.5 mL每组三份，共九份。按照“2.2.2”供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项下色谱条件，精密吸取10 μL，注入高效液相色谱仪测定，结果见表6，根据其回收率计算其RSD值为2.968%。

2.8 样品测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定，计算得到棘豆止咳散散剂中甘草苷的含量为0.3526%。

3 讨论

《传统蒙药与方剂》[9]中记载，多叶棘豆有杀粘、清热、燥协日乌素、愈伤、生肌、锁迈止血、消肿的功效。川贝母为传统的止咳化痰良药，相关报道[10-12]指出：黏稠的痰会造成呼吸道阻塞而感染，并刺激呼吸道引起咳嗽，川贝母可降低痰液黏稠度，同时对平滑肌有松弛作用，有良好的祛痰作用。甘草为一种使用很广泛的中草药，主要功效益气补中、去痰止咳、解毒、缓急止痛、调和药效等[13]。相关研究[14]指出，服用甘草后，其通过缓和炎性刺激达到镇咳效果，并促进支气管黏膜分泌使痰咳出。石膏为中医临床常用药，具有清热泻火，抗病毒等功效。棘豆止咳散广泛应用于临床，治疗巴达干、其素偏盛性肺病、哮喘等疾病。综上所述，棘豆止咳散的传统应用与现代研究结果有很多的相关之处和一致性，为后期棘豆止咳散的开发研究奠定实验基础。

表6 样品含量测定结果

由于多叶棘豆只有部颁标准，未有中国药典标准，研究尚不明确。川贝母在棘豆止咳散中的比例小，指标成分含量小，暂时尚未研究。石膏其主要化学成分是硫酸钙，所以本实验暂不研究。因此，本实验选择了甘草中的甘草苷作为研究对象。这只是初步研究，笔者团队接下来会进一步研究棘豆止咳散中的其他成分，为棘豆止咳散的质量控制做出依据。

本实验还比较了甲醇-水、乙腈-水的梯度洗脱系统，发现以乙腈-水为流动性，检测波长为237 nm时，被测组分的分离效果好，分离度符合要求。从表2可以看出，其r2=0.9993，说明甘草苷在该范围内有良好的线性关系。从表3～5可以看出，其精密度、稳定性、重复性的RSD值均小于3.0%，其回收率在90.19%～97.87%，建立的方法学考察指标均符合药典规定，上述结果表明该实验所建立的含量测定方法简便，可靠，重复性好，可用于棘豆止咳散的质量控制，为该制剂的质量评价及深层次开发利用提供科学依据。