河北省唐山地区人群红细胞A2B亚型分布情况及其分子机制的研究*

李 君，曹立瀛，侯金友，张 慧，邹红蕊，孙 超，崔振超

(1.开滦总医院输血科，河北唐山 063000；2.唐山市中心血站，河北唐山 063000； 3.秦皇岛市中心血站，河北秦皇岛 066000)

ABO血型系统在临床输血中占有极其重要的地位，血型鉴定是保障输血安全的必要前提[1]，但实际工作中经常遇到正反定型不相符致血型鉴定困难的病例，亚型是导致正反定型不符的常见原因之一，其中以A2/A2B最常见。研究显示一定比例的A2或A2B个体血清中含有抗-A1抗体，且A2B个体检出抗-A1抗体的比例高于A2个体[2-3]，当A2B型受血者血清中存在37℃条件下反应的抗-A1抗体时，输入AB型血液可能导致溶血性输血反应或输注无效。但目前我国没有要求常规检测A2抗原，输血前试验存在漏检的可能。因此开展A2B亚型检测能提升输血安全性，有效减少溶血性输血反应[3-4]。本文通过研究河北省唐山地区人群A2B亚型的分布情况及分子机制，从而探讨输血前开展A2B亚型检测的临床意义，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2017年11月～2018年3月在本院进行血型检测的所有住院、门诊、急诊患者及体检人员，选择血型为AB表型的人群进行研究。采集患者或体检人员EDTA抗凝血标本各2管，1管进行血清学试验，1管进行ABO基因扩增及测序。

1.2 试剂与设备 单克隆抗-A、抗-B试剂、抗-H试剂、抗-A1试剂购自上海血液生物医药有限责任公司；抗-AB购自法国Diagast公司；反定型试剂细胞、抗筛细胞、ABO，RhD血型定型检测卡、抗人球蛋白检测卡购自长春博迅生物技术有限责任公司，所有试剂均在有效期内使用。BASO血库专用离心机、TD-3A离心机、FYQ免疫微柱孵育器。

1.3 方法

1.3.1 血清学检测：微柱凝胶卡式法检测ABO，RhD血型按照试剂说明书进行操作。微柱凝胶卡式法ABO正反定型为AB型的标本，采用试管法抗-A1和抗-H试剂初筛。与抗-A1反应阴性，再次复核ABO正反定型试验；其中正定型与抗-A、抗-B、抗-A1、抗-AB、抗-H反应，反定型与Ac，Bc，Oc，自身细胞(4℃，室温，37℃)反应，试管法血型定型参考文献[5]操作。

1.3.2 基因组DNA提取：采用MagCore Nucleic Acid Extractor提取仪器进行全基因组DNA抽提，严格按照试剂说明书进行操作。标本A260nm/A280nm比值为1.70～1.90，调节标本DNA浓度为50～100 ng/μl。

1.3.3 ABO基因扩增和测序分析：参照文献[6]进行操作。简要如下：采用特异性引物扩增外显子6～7序列，扩增反应总体积20 μl，包括10×PCR缓冲液，DNA，LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司产品，大连)；dNTP和MgCl2终浓度分别为0.2 mmol/L和2.0 mmol/L，引物终浓度为0.5 μmol/L。扩增产物经酶切纯化后进行测序反应，测序产物在ABI PRISM 3730测序仪进行电泳分析。使用SeqScape V2.5软件进行序列分析比对，根据碱基多态性判定标本ABO等位基因型。ABO等位基因参照国际输血协会(ISBT)工作组的命名原则。

1.4统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计数资料用百分率(%)表示。

2 结果

2.1 A2B亚型的分布情况 535例AB表型案例，其中男性278例，女性257例。在535例AB型样本中，检出12例A2B亚型标本，比例为2.24%。

2.2 A2B个体ABO基因测序情况 基因测序显示2例标本基因型为ABO*A2.01/ABO*B.01，6例为ABO*A2.05/ABO*B.01，1例为ABO*BA.02/ABO*O.01.02，3例为ABO*A1.02/ABO*B.01。人群ABO*A2.05等位基因频率为0.56%，ABO*A2.01为0.19%。12例标本碱基序列多态性情况见表1。ABO基因双链测序分析见图1。

表1 12例标本碱基序列多态性情况

图1 ABO*A2.01/ABO*B.01基因型标本(上图,箭头所指处为c.1061C/del杂合)和ABO*A2.05/ABO*B.01基因型标本(下图，箭头所指处为c.1009AG杂合)

3讨论血型鉴定是保证临床输血安全的首要环节，通常利用血清学技术可准确鉴定ABO表型，但人群中存在一定比例ABO亚型，它们往往表现为抗原抗体减弱或者正反定型不一致，不仅干扰输血前血型鉴定试验，还影响输血的安全和效果[7-8]。现已知ABO血型系统存在的亚型中以A2和A2B较为常见，但目前我国输血前试验没有要求常规检测A2抗原，存在A2或A2B亚型漏检的可能。若将献血者A2B亚型误定为AB型输注给AB型患者，不会导致溶血性输血反应的发生；但对于受血者而言，将A2B亚型误定为AB型，输血后则有可能刺激患者产生抗-A1抗体[3-4]，从而导致迟发型溶血性输血反应或输注无效的发生。因此A2B个体的输血问题应引起临床重视。

YING等[9]对浙江汉族人群的研究发现A2B在AB人群中的比例为1.96%，OGASAWARA等[10]研究发现，日本东京人群中A2B在AB型频率为0.16%，本实验的筛查数据表明唐山地区人群中存在一定比例的A2B亚型。国外研究显示1%～8%的A2个体血清中含有抗-A1抗体，22%～35%的A2B个体血清中含有抗-A1抗体[2]，但是本实验中我们在12例A2B个体均未发现抗A1抗体，这与YING等[9]报道的研究结果一致，他们在134例A2和A2B个体中只发现1例存在抗A1抗体，提示中国人群中A2或A2B个体血清中含有抗-A1的概率远低于白种人群[9]。

A2表型的分子机制主要是ABO基因碱基的点突变或缺失[9]，目前ISBT正式命名的A2等位基因有18个[11]。我们的实验结果显示本地区以ABO*A2.05为主，与国内其他地区的研究结果相符[9，12-13]。与ABO*A1.02等位基因进行比较，ABO*A2.01在1 061位C缺失从而引起移码突变，使得A2糖基转移酶与A1糖基转移酶相比活力降低了30～50倍[10]。而ABO*A2.05仅存在1009位A>G，导致337位精氨酸变为甘氨酸，推测这个氨基酸的改变可能降低了糖基转移酶的活性。此外还检出1例罕见ABO*BA.02等位基因，由于B(A)表型与A2B个体的血清学特性基本相似，常规的筛选中可能将B(A)表型误认为A2B表型，但正确鉴定B(A)亚型，对新生儿溶血病的防治和安全输血有着极其重要的作用。本实验中我们发现3例A2B标本基因型为正常的ABO*A1.02/ABO*B.01基因型，YING等[9]通过ABO基因全部外显子研究结果也显示浙江汉族人群部分A2B个体，在测序序列范围内未发现突变。他们推测表观遗传、内含子红系特异性调控元件或其他机制可能影响这些A2B个体抗原的表达，这有待于进一步研究。

综上所述，河北省唐山地区人群中存在一定比例的A2B亚型，准确的血型鉴定有助于提升输血的安全性和有效性，可预防不相合输血导致的溶血性输血反应或输注无效。