崖柏组织培养初探

王毅敏 高 晗 高本旺 宋正江 陈发菊

(1.三峡植物园 宜昌 443111；2.三峡大学 宜昌 443000)

崖柏(Thujasutchuenensis)为柏科崖柏属(Thuja)常绿乔木。有“植物大熊猫”、“活化石”之称，是我国特有国宝级濒危植物。因其生长在悬崖峭壁上，故而得名为“崖柏”[1]。它的分布范围和居群数量己非常有限,仅发现于重庆市城口大巴山自然保护区和开县雪宝山自然保护区、四川省万源市花粤山自然保护区和湖北省保康县五道峡自然保护区[2-3]，现在湖北省兴山县榛子乡也只发现零星小居群。在实际观测过程中发现,崖柏居群分布地海拔较高,且常处于陡峭的山脊及山脊两侧,自然条件恶劣(所受风力较大,气候寒冷),土壤层薄,营养状况差。现存的崖柏居群,处于岛屿状的破碎生境中,各个居群植株数量少(而且有效居群大小远远低于实际大小),大多呈小乔木或多分枝的大灌木状态[4]。

崖柏由于自身固有的生物学特性和自然分布区恶劣的生态条件，具有发育缓慢、生殖迟缓、大种子、小收获量和寿命长的特点。造成结实量低，种源奇缺，且种质差，种子空粒多，种皮坚硬，发芽率低，播种有隔年出苗的习性，靠种子繁殖困难。而利用扦插繁殖存在着年龄效应、位置效应及取材困难等诸多问题[5-6]。崖柏耐干旱适应性强，适宜作为干旱立地条件栽培，目前的研究还处于种苗繁育阶段，大大地限制了其推广。所以，采用组织培养法对崖柏进行离体快速繁殖探索具有重要的理论价值和明显的现实意义。

1 试验材料及方法

1.1 试验材料

试验材料是2016年4月采自湖北省宜昌市兴山县榛子乡，选择尚未木质化的当年生枝条，先用洗洁净将表面灰尘杂物刷洗干净，再用流动清水冲洗1.5～2 h，将洗净后的外植体剪成3～4 cm小段，置烧杯中，晾干备用。

1.2 试验方法

1.2.1 0.1%升汞消毒处理外植体效果选择试验

外植体先用75%酒精消毒 1 min，无菌水冲洗5次，然后用0.1%升汞消毒处理，无菌水冲洗5次，置无菌纸上，晾干后切成约1～2 cm长带节茎段作为外植体，接种到事先准备好的无菌培养基上，0.1%升汞消毒时间分别为4、6、8、10、12、14 min，每个处理设3个重复，每个重复接90个。20 d后调查统计污染率、杀伤率，分析适宜的升汞消毒时间。

1.2.2 不同盐浓度对外植体生长的影响

以MS为基本培养基，调整大量元素的用量，设MS、1/2MS、1/4MS、0MS 4 个浓度梯度培养基，在无菌条件下，将消毒后的外植体切成约1～2 cm长的茎段分别接种到事先准备好的不同盐浓度的无菌培养基中，共设4个处理，每个处理3个重复，每个重复接30个，置于培养架上培养，30 d后观察不同盐浓度对外植体生长的影响，确定适宜的诱导培养基盐浓度。

1.2.3 统计计算方法

外植体消毒试验是组织培养获得无菌系的关键，试验结果统计用到的公式：

污染率(%)=(污染外植体数/接种外植体数)×100(接种20天后统计污染外植体数)

杀伤率(%)=(杀伤外植体数/接种外植体数)×100(接种20天后统计杀伤外植体数)

诱导率(%)=(成苗外植体数/接种外植体数)×100(接种30天后统计统计成苗数)

采用SPSS软件对不同消毒时间污染率、杀伤率差异进行分析。

2 试验结果与分析

2.1 0.1%升汞消毒处理外植体效果

统计不同消毒时间处理的三个重复的污染株数计算平均污染率和杀伤率见表1，消毒效果见图1。

图1 0.1%Hgcl 不同消毒时间对消毒效果的影响

表1 0.1%升汞不同消毒时间对消毒效果的影响

(注：培养室环境温度 23～27 ℃，每日光照12～14 h，光照强度1500～2000 Lx ，相对湿度40%～80%。培养基以MS为基本培养基，蔗糖添加量30 g/L，琼脂4.2 g/L，pH值5.8。)

表2 不同消毒时间污染率和杀伤率分析

用SPSS软件对污染率和杀伤率进行分析，说明不同消毒时间之间的污染率差异是极显著的，处理6的污染率最低；处理1～5的杀伤率差异不显著，处理6的杀伤率最高，故而，综合考虑污染率和杀伤率的各时间段差异，处理5污染率较低，杀伤率也低，且时间短，所以选处理5。对试验结果图表数据综合分析之后得出：消毒时间在4 min至14 min之间崖柏外植体在0.1%升汞中的消毒效果差异显著，杀伤率先为零，当消毒时间达到10 min以后杀伤整体趋势是逐渐增大，当0.1%升汞消毒时间达到12 min(处理 5)的时候污染率低，杀伤率也处于较低水平，表面灭菌效果最好,见表2。

2.2 不同盐浓度对外植体生长的影响

表3 不同盐浓度对外植体生长的影响

30天后统计试验结果(表3)显示，随着盐浓度的降低，平均生长量先升高后降低，生长状况由MS培养基上的强壮深绿到对照的弱小黄化；叶色随着盐浓度的降低而变浅，当大量元素浓度为0时，新生叶黄化或白化。第2组处理 1/2MS 盐浓度时生长状况及生长量最好，新生芽深绿健壮，表明盐浓度过高或过低对外植体生长都不利，比较理想的培养基盐浓度应该选择1/2MS。

3 结论与讨论

3.1 结论

崖柏外植体外植体先用75%酒精消毒 1 min，无菌水冲洗，0.1%升汞消毒处理随时间的延长杀伤率增高、污染率降低，0.1%升汞消毒时间达到12 min(处理 5)的时候污染率最低，杀伤率也处于较低水平，表面灭菌效果最好。

培养基盐浓度过高或过低对崖柏外植体生长都不利，1/2MS 盐浓度时生长状况及生长量最好，新生芽深绿健壮。外植体随着盐浓度的降低，平均生长量先升高后降低，叶色随着盐浓度的降低而变浅，当大量元素浓度为0时，新生叶黄化或白化。

3.2 讨论

崖柏组织培养研究未见报道，但近缘植物松科中的雪松、白皮松、金钱松、长白落叶松和兴安落叶松，柏科中的黄柏、侧柏、绒柏、金黄球柏、叉子圆柏的组织培养国内外有一些报道，大多数研究者选择生长季节采取外植体，消毒处理后进行培养[7-9]。外植体的消毒方法很多，其中酒精与升汞交互消毒是目前使用广泛、效果较好的消毒方法。对侧柏、绒柏、叉子圆柏、崖柏等柏科植物，枝叶外备较厚角质层，有油脂，消毒灭菌难是普遍问题。用延长消毒时间的办法来解决这个问题，但消毒时间过长又容易杀伤组织，成活率降低。故而，本试验选取当年生崖柏茎段做外植体，适宜的消毒时间为75%酒精浸泡1 min，0.1%升汞消毒12 min，效果较好。

齐力旺等(1995)在侧柏的组织培养和植株再生试验研究结果表明，SH培养基不适于侧柏组织培养，并筛选出基本培养基为MS培养基[9]。王建华等(2006)在绒柏的组织培养和植株再生,实验结果表明基本培养基为MS培养基[10]；李春艳等(2000)在臭柏愈伤组织的诱导试验研究结果表明在离体培养条件下，取当年生叉子圆柏茎尖、茎段、叶及根尖为外植体，在MS培养基上获得愈伤组织[11]。本试验以MS培养基为基础，得到比较理想的崖柏茎段分化诱导产生愈伤组织的培养基为 1/2MS，为今后进一步研究崖柏无菌系建立的方法，建立无菌系继续扩大基本培养基、生长调节物质和创造利于生根的各种环境等奠定了基础。