油茶叶多酚的提取工艺优化及其体外抗氧化性的研究

蓝梧涛，吴雪辉，2，章 文，王泽富，江盛宇

(1.华南农业大学 食品学院，广州 510642； 2.广东省油茶工程技术研究中心，广州 510642)

多酚是苯环上具有多元酚羟基结构的化合物总称，广泛分布于植物中的各个部分，具有较强的清除自由基、抗肿瘤、抗炎抗癌、降血脂的作用，在食品、药品、营养保健、日用化工等领域具有良好的应用价值[1-2]。据报道[3-4]，被作为废弃物丢弃的植物叶片中含有较高含量的多酚，若能合理开发，必然具有重要的应用价值。

油茶籽油含有多种活性成分，具有较高的保健价值及药用功效，长期食用有益于人体健康[5-7]。近些年，油茶的种植面积逐年增加，为促进油茶的生长发育及提高油茶果产量，每年需要对油茶树进行修枝整形，在此过程中会产生大量的油茶叶，而大部分油茶叶利用度较低[8-11]。

研究表明，油茶叶富含多酚、黄酮、多糖、三萜皂苷、甾体等物质，其提取液具有降血糖、抗凝血、抗血栓形成等功效，若能有效利用其中的活性成分，可以提高油茶的经济价值[12-13]。目前与油茶叶活性成分相关的研究主要集中在黄酮[14-15]，针对多酚的研究相对较少。为了进一步研究油茶叶多酚的功效，本文以油茶叶为原料，研究油茶叶中多酚的提取工艺，并对油茶叶多酚与VC进行体外抗氧化活性的分析，以充分利用油茶叶资源，变废为宝，推动油茶产业的发展。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油茶叶，采摘于华南农业大学增城宁西教学科研基地。

无水乙醇、无水碳酸钠、福林酚、过硫酸钾、浓盐酸、Tris、邻苯三酚、抗坏血酸：分析纯；没食子酸、DPPH、ABTS标准品。

BSA223S型分析天平，UV-5200紫外可见分光光度计，JB-3型恒温磁力搅拌器，WRH-100TB1型闭环除湿热泵干燥机，BJ-150型多功能粉碎机，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵。

1.2 试验方法

1.2.1 原料的预处理

新鲜、无病虫害的油茶叶采用热泵于60℃条件下干燥至恒重，粉碎，收集40～60目的粉末，备用。

1.2.2 油茶叶多酚的提取

称取适量油茶叶粉末，加入一定体积分数的乙醇溶液，在适宜的温度下进行搅拌提取一段时间，抽滤收集提取液，定容至50 mL，测定多酚含量，并按下式计算多酚提取量。

式中：C为根据标准曲线计算出的提取液中多酚质量浓度，μg/mL；N为稀释倍数；M为油茶叶质量,g。

1.2.3 多酚含量的测定

多酚含量按照GB/T 8313—2008的步骤，采用福林酚比色法进行测定[16]。

1.2.4 体外抗氧化活性测定

DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力的测定参照文献[17]进行。

1.2.5 数据处理

所有试验重复3次，采用Design-Expert 8.0.6、Origin 9.0、Matlab R2016b软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对多酚提取量的影响

称取1.000 g油茶叶粉末5份，分别加入体积分数20%、30%、40%、50%、60%的乙醇溶液40 mL，在50℃的条件下搅拌提取15 min，抽滤收集提取液定容至50 mL，测定吸光值并计算多酚的提取量。结果见图1。

图1 乙醇体积分数对多酚提取量的影响

由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，多酚提取量呈现先增加后降低的趋势，乙醇体积分数在30%～50%范围内，多酚提取量较高，这是由于多酚属于弱极性物质，在一定范围内，随着乙醇体积分数的增加，溶液体系的极性降低，使得提取量增大。当乙醇体积分数超过50%时，多酚提取量开始下降，可能是由于溶液体系的极性与油茶叶多酚极性之间的差异增大，导致提取量降低。

2.1.2 提取时间对多酚提取量的影响

以40%的乙醇溶液为提取溶剂，提取时间分别为5、15、25、35、45 min，其余条件同2.1.1进行提取。结果见图2。

图2 提取时间对多酚提取量的影响

由图2可知，随着提取时间的延长，多酚提取量逐渐增加，当提取时间达到35 min时，多酚提取量最大，为56.71 mg/g，此后，延长提取时间，提取量反而有所下降。根据菲克定理，在一定范围内，油茶叶颗粒内部与溶剂中的多酚浓度差较大，提取时间与多酚提取量呈现较好的线性关系，随着提取时间延长，颗粒内外浓度差逐渐趋于平衡，提取量不再增大，再延长提取时间，提取量下降可能是由于多酚暴露在空气中，发生部分氧化。

2.1.3 提取温度对多酚提取量的影响

分别设定提取温度为30、40、50、60、70℃，乙醇体积分数为40%，其余条件同2.1.1进行提取。结果见图3。

图3 提取温度对多酚提取量的影响

由图3可知，多酚提取量随着提取温度的升高先增加后降低。这是由于适当地升高提取温度，分子运动速率加快，有利于油茶叶多酚的溶出。当提取温度达到60℃时，多酚提取量最高，为59.91 mg/g。

2.1.4 料液比对多酚提取量的影响

以40%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，其余条件同2.1.1进行提取。结果见图4。

图4 料液比对多酚提取量的影响

由图4可知，随着料液比的增加，多酚提取量迅速增大，这是由于增大溶剂用量，有利于多酚物质由颗粒内部向溶剂扩散。当料液比为1∶60时，多酚提取量达到57.27 mg/g，此后再增大料液比，多酚提取量基本不变。

2.2 响应面优化试验

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计原理，选取提取时间(X1)、提取温度(X2)、乙醇体积分数(X3)、料液比(X4)作为自变量，油茶叶多酚提取量(Y)为响应值，设计四因素三水平响应面试验方案。响应面试验因素水平见表1，响应面Box-Behnken试验设计及结果见表2。

表1 响应面试验因素水平

表2 响应面Box-Behnken试验设计及结果

采用Design-Expert软件对表2的数据进行回归拟合，得到多酚提取量(Y)的二元多项回归方程：

对回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3 回归方程方差分析

注：* *差异极显著(P<0.01),*差异显著(P<0.05)。

通过对模型的拟合分析，预测出最佳的提取条件为：提取时间35 min，提取温度68.84℃，乙醇体积分数31.63%，料液比1∶68.41，预测的油茶叶多酚提取量为68.18 mg/g。

2.3 验证试验

为了验证模型的准确性，考虑到实际操作，将各因素调整为提取时间35 min、提取温度69℃、乙醇体积分数32%、料液比1∶69，进行验证试验，得到油茶叶多酚提取量为67.31 mg/g,预测值与实测值的相对误差为1.29%。说明模型能较好地预测油茶叶多酚提取量。

2.4 油茶叶多酚对DPPH·的清除能力

图5为不同质量浓度的油茶叶多酚和VC对DPPH·的清除效果。

图5 油茶叶多酚和VC清除DPPH·的比较

由图5可知，在一定范围内，随着质量浓度的增加，油茶叶多酚和VC对DPPH·的清除率均逐渐增大，表现出较好的抗氧化效果。在质量浓度为3.9～11.36 μg/mL范围内，油茶叶多酚对DPPH·的清除率与质量浓度呈现一定的线性相关性，回归方程为Y=0.055 8X+0.272 5(R2=0.973 9)，IC50值为4.22 μg/mL，当质量浓度超过11.36 μg/mL，清除率缓慢升高，最大清除率为90.2%；对于VC，在质量浓度为3.82～15.26 μg/mL范围内，线性回归方程为Y=0.054 5X+0.022 6(R2=0.984 6)，IC50值为8.073 μg/mL，最大清除率略低于油茶叶多酚，为81.86%。综上所述，油茶叶多酚较VC对DPPH·清除能力更强。

2.5 油茶叶多酚对ABTS+·的清除能力

图6为不同质量浓度的油茶叶多酚与VC清除ABTS+·的能力。

由图6可知，油茶叶多酚对ABTS+·的清除能力与质量浓度呈正相关的关系，质量浓度越大，清除能力越好，IC50值为5.22 μg/mL，当质量浓度为19.17 μg/mL时，ABTS+·清除率达到100%。而VC的IC50值为8.69 μg/mL，在19.17 μg/mL时，ABTS+·清除率达到99.65%。由此可知，与清除DPPH·的结果类似，油茶叶多酚清除ABTS+·的活性同样优于VC，并且当油茶叶多酚达到一定的质量浓度时，能完全清除ABTS+·。

图6 油茶叶多酚和VC清除ABTS+·的比较

2.6 油茶叶多酚对的清除能力

图7 油茶叶多酚和VC清除的比较

3 结 论

在单因素试验的基础上，通过响应面试验优化得到油茶叶多酚的最佳提取条件为提取时间35 min、提取温度69℃、乙醇体积分数32%、料液比1∶69，在此条件下，油茶叶多酚的提取量为67.31 mg/g。