连翘炒制前后多种成分含量比较及工艺初探*

2019-04-27 03:13丁芳芳吕慧利
光明中医 2019年7期
关键词:芦丁连翘炮制

丁芳芳 张 瑞 吕慧利

连翘,为木犀科植物连翘Forsythiasuspensa(Thunb.)的干燥果实,连翘首载于《神农本草经》,言其“味苦、平,主寒热,鼠瘘瘰疠,痈肿恶疮,瘿瘤,结热”。连翘具有清热解毒、消肿散结、疏散风热之功效,现代研究表明,连翘具有抑菌作用,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、大肠埃希菌、幽门螺杆菌等都具有明显的抗菌活性[1,2],以及抗病毒、抗炎、抗氧化、抗过敏、抗癌活性[3],山西为连翘的主产区之一,上党地区的名医们在临床实践中,积累了诸多应用连翘的心得,他们认为连翘过于苦寒,在治疗内科杂病时,根据患者病情,于入药前将连翘炒制,去性存用,为山西上党地域的经验用药。本次研究选取连翘中3个主要有效成分:连翘苷、连翘酯苷、芦丁为检测目标,观测其炮制前后含量变化,初步探讨炒连翘的物质基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器安捷伦1260高效液相色谱仪,DEAAX08007二极管阵列检测器,KQ-500DB数控超声波清洗器,FLUKE F59红外测温仪。

1.2 药品与试剂连翘酯苷标准品(购于成都曼斯特生物科技有限公司,MUST-17022405),连翘苷标准品(购于成都曼斯特生物科技有限公司,MUST-17031610),芦丁标准品(购于成都曼斯特生物科技有限公司,MUST-17122001),甲醇为色谱纯,水为超纯水,论文中所涉及的其他试剂均为分析纯。连翘为山西连翘,批号分别为:20170403,20171001,20171006,粉碎过5号筛。

2 方法

2.1 色谱条件

2.1.1 连翘苷的色谱条件色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈-水(25∶75)为流动相洗脱,检测波长为277 nm;流速0.8 ml·min-1,柱温为室温,理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000[4]。

2.1.2 连翘酯苷的色谱条件色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈-0.4%冰醋酸(15∶85)为流动相洗脱,检测波长为330 nm;流速0.6 ml·min-1,柱温为室温,理论板数按连翘酯苷峰计算应不低于5000[4]。

2.1.3 芦丁的色谱条件色谱柱为ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);以甲醇-水(45∶55)为流动相洗脱,检测波长为365 nm;流速1 ml·min-1,柱温为室温,理论板数按芦丁峰计算应不低于2000[5]。

2.2 对照品溶液的配制

2.2.1 连翘苷对照品溶液的配制精密称取连翘苷对照品6.62 mg置20 ml量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,既得浓度为327.92 μg·ml-1的对照品溶液。

2.2.2 连翘酯苷对照品溶液的配制精密称取连翘酯苷对照品2.63 mg置20 ml量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,既得浓度为130.63 μg·ml-1的对照品溶液。

2.2.3 芦丁对照品溶液的配制精密称取芦丁对照品1.74 mg置20 ml量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,既得浓度为86.96 μm·ml-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的配制

2.3.1 连翘苷供试品溶液的配制精密称取0.5 g连翘粉末置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇15 ml,称定重量,浸渍过夜,超声处理25 min,放冷,称定重量,用甲醇补足减失重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5 ml,蒸至近干,加中性氧化铝0.5 g拌匀,加在中性氧化铝柱(100~120目,1 g,内径为1~1.5 cm)上,用70%乙醇80 ml洗脱,收集洗脱液,浓缩至干,残渣用50%甲醇溶解,转移至5 ml量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,既得。

2.3.2 连翘酯苷供试品溶液的配制精密称取0.05 g连翘粉末置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇150 ml,称定重量,超声30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足缺失的重量,摇匀,滤过,取续滤液既得。

2.3.3 芦丁供试品溶液的配制精密称取0.5 g连翘粉末置于具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 ml,称定重量,超声30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足缺失的重量,摇匀,滤过,取续滤液既得。

2.4 标准曲线的绘制精密移取上述对照品溶液适量,加甲醇稀释为1、2、3、4、5、6号标准品溶液,分别含连翘苷、连翘酯苷和芦丁的梯度浓度。对照品溶液分别进样10 μl,以色谱峰面积(Y)为纵坐标,浓度(X)为横坐标,做线性回归。连翘苷的回归方程为:y=5.9769x+7.7299,r= 1.0000,线性范围为10.25~327.92 μg·ml-1;连翘酯苷的回归方程为:y=9.4900x+3.9411,r=0.9994,线性范围为4.08~130.63 μg·ml-1;芦丁的回归方程为:y=17.8510x-12.1370,r=0.9999,线性范围为2.72~86.96 μg·ml-1。见表1。

表1 各标准品溶液中物质浓度 (μg·ml-1)

2.5 精密度试验分别精密吸取连翘苷、连翘酯苷、芦丁对照品溶液10 μl,重复进样6次,测定峰面积,结果显示连翘苷、连翘酯苷、芦丁的峰面积RSD分别为:1.01%、0.44%、0.89%,说明该方法精密度良好。

2.6 重复性试验取同一连翘药材(批号20171001)粉末6份,按照2.3项下方法制备供试品溶液,分别进样10 μl,依2.1法测得连翘苷、连翘酯苷、芦丁的峰面积RSD值分别为:1.69%、1.14%、0.71%。说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验精密吸取供试品溶液10 μm,按照2.1法分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定,测得连翘苷、连翘酯苷、芦丁的峰面积RSD值分别为:0.88%,0.70%,0.72%。说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验取已知含量的连翘粉末,加入一定量对照品,按供试品制备方法制备样品,测得连翘苷、连翘酯苷、芦丁含量,计算回收率,6次测得的平均回收率,连翘苷为98.73%,RSD为2.6%;连翘酯苷为99.77%,RSD为1.84%;芦丁为98.26%,RSD为2.26%。见表2~表4。

表2 连翘苷加样回收试验

表3 连翘酯苷加样回收试验

表4 芦丁加样回收试验

3 含量测定

3.1 不同温度相同时间炒连翘主要有效成分含量变化取同一批次连翘500 g各5份,用测温枪确定炒锅温度,分别用110 ℃、130 ℃、150 ℃、170 ℃、190 ℃火力快速翻炒12 min,冷却,记录失重,粉碎,过5号筛。依前法处理,测得发现当温度升高到170 ℃,3种有效成分均开始下降,见图1。

图1 不同温度相同时间炒连翘有效成分含量变化

3.2 相同温度不同时间炒连翘主要有效成分含量变化取同一批次连翘500 g各5份,用测温枪确定炒锅温度150 ℃,快速翻炒6 min、9 min、12 min、15 min、18 min,冷却,记录失重,粉碎,过5号筛。依前法处理,测见随炒制时间延长,连翘苷、芦丁变化不明显,连翘酯苷含量自15 min时快速下降,见图2。

图2 不同时间相同温度炒连翘有效成分含量变化

据此确定2因素3水平正交试验的条件,温度:130 ℃、150 ℃、170 ℃,时间:9 min、12 min、15 min。

3.3 正交试验取同一批次连翘500 g各9份,如下述条件炒制样品9份,冷却,记录失重,粉碎,过5号筛。依前法处理,结果见表5。

3.4 重复试验将上述结果进行统计分析,发现炮制温度对连翘有效成分的影响大于炮制时间,炒连翘适宜炮制条件为150 ℃,炒制9~12 min,继续进行3批次重复验证,选取150 ℃,12 min为炮制条件,按前法处理连翘样品,结果见表6。

表6 不同批次生炒连翘有效成分含量对比

注:t检验结果显示:连翘苷、芦丁相比P<0.05,差异具有统计学意义。

4 讨论

炒连翘为山西上党地区沿用多年的地方经验用药,属我院临方炮制品种,我市名老中医张跃英认为,生连翘过于苦寒,久服耗伤人体正气,炒制连翘去性存用,更适合慢病久病之人,她常用炒连翘治疗慢性胃炎、胰腺炎、胆囊炎等病,证见湿重于热者,且中病即止,不可久服。

本试验旨在观察连翘炮制前后连翘苷、连翘酯苷、芦丁的含量变化,为炒连翘提供试验依据。

实验结果表明,炒制连翘,提升了连翘苷的含量,降低了芦丁的含量,而连翘酯苷含量变化不明显,这可能是因为炒制提高了连翘苷的溶出率,而芦丁属于受热不稳定成分,随温度升高,含量逐渐降低。

炒制温度与炒制时间相比,炒制温度对连翘的有效成分含量影响更大,随着炒制温度升高,3种有效成分含量均迅速下降,说明炒制连翘需控制好温度。我们既往经验是中火炒制到连翘充分爆壳,这与试验观察基本吻合:150 ℃火力,翻炒9~12 min至连翘充分爆壳开裂为度。

中药有效成分非常复杂,以上试验,仅为炒连翘物质基础的一个初探,今后,我们还会从其他试验角度,继续对比生、炒连翘的物质变化,以期逐步揭示炒连翘的物质基础。

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